A1/Bfl-1 Antibody (Rabbit mAb) [N2F22] Datasheet

生物描述

特异性	A1/Bfl-1 Antibody (Rabbit mAb) [N2F22] 可检测内源性 A1/Bfl-1 总蛋白水平。
背景	A1/Bfl-1 (BCL2A1) 是 Bcl-2 蛋白家族的抗凋亡成员，最初在小鼠骨髓中被鉴定为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 诱导基因，主要在造血细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞）中表达，在肺和血管内皮等非造血组织中的检测有限。 A1/Bfl-1 包含四个 Bcl-2 同源 (BH) 结构域，这些结构域组成八个 α 螺旋，其中 α4、α5 和 α6 螺旋分别对应于 BH3、BH1 和 BH2 结构域，在蛋白表面形成一个疏水沟槽，用于与促凋亡的 Bcl-2 家族成员相互作用。然而，A1 在该结合沟槽的第 78 位氨基酸残基具有独特的酸性谷氨酸残基，这使其相互作用特异性与其他抗凋亡蛋白有所区别。该蛋白在结构上与 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 和 Mcl-1 的不同之处在于其亲水性 C 端结构域，该结构域缺乏跨膜锚定结构，而是包含泛素化位点，可导致快速的蛋白酶体降解，使其半衰期仅为约 30 分钟，与 Mcl-1 相当，但与 Bcl-2 长达 24 小时的稳定性形成鲜明对比。 A1/Bfl-1 的表达可通过 NF-κB 转录激活迅速诱导，以响应多种炎症刺激，包括 TNF-α、IL-1β、CD40 配体结合、佛波酯、脂多糖以及通过 PLCγ/PKC/NF-κB 通路发挥作用的前 T 细胞受体信号传导，这使得 A1 成为一种即刻早期生存反应基因。该蛋白通过高亲和力结合并中和仅含 BH3 结构域的促凋亡蛋白（包括 Bid、Bim 和 Puma），同时不与 Bad 蛋白结合，从而阻止这些凋亡激活因子触发 Bax/Bak 寡聚化和线粒体外膜通透性增加，否则这些过程将导致细胞色素 c 释放并启动 caspase 依赖性凋亡。 A1/Bfl-1优先与Bak而非Bax相互作用，其直接结合可拮抗Bak介导的细胞死亡。然而，有报道指出，不同物种的A1/Bfl-1存在差异：小鼠A1主要定位于胞质，需要相互作用蛋白才能发挥其抗凋亡作用；而人A1/Bfl-1则优先靶向线粒体。该蛋白在淋巴细胞发育过程中发挥着关键的存活功能——A1表达在DN3向DN4胸腺细胞过渡期达到峰值，此时前TCR信号依赖的A1诱导对于β选择进程是必要且充分的；在CD4+单阳性胸腺细胞中，A1的表达水平比双阳性细胞高30倍；在T细胞受体激活后，外周T细胞中A1与Noxa共同显著上调，从而促进携带高亲和力TCR的抗原特异性克隆的存活。 A1/Bfl-1通过NF-κB激活，在B细胞受体和PLCγ2信号通路下游调控成熟滤泡B细胞的存活，使滤泡B细胞对BCR诱导的细胞凋亡具有抵抗力，从而避免在阴性选择过程中清除过渡性B细胞。系统性红斑狼疮患者的B细胞中A1表达升高，反映了免疫耐受机制的失调。该蛋白通过NF-κB依赖性转录，抑制G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-8和脂多糖刺激引起的自发性细胞凋亡，从而延长中性粒细胞在细菌感染和炎症反应中的存活时间。A1-a亚型的缺失会消除LPS介导的中性粒细胞存活增强作用，但由于代偿性祖细胞活性，稳态和炎症状态下的粒细胞数量仍保持正常。 A1/Bfl-1通过激活NF-κB通路促进巨噬细胞在感染牛分枝杆菌卡介苗、弓形虫和结核分枝杆菌期间的存活，该通路在感染后8至16小时内达到峰值。然而，矛盾的是，A1/Bfl-1抑制毒性结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中自噬体的成熟和酸化，从而阻断自噬介导的杀伤作用和宿主细胞凋亡，使细菌得以在细胞内持续存在。A1与Mcl-1在肥大细胞存活方面具有功能冗余性，二者共同通过维持含有富含组胺的炎症颗粒的组织驻留肥大细胞的存活来介导过敏反应的严重程度。钙蛋白酶可水解切割A1/Bfl-1的N端区域，产生促凋亡的C端片段，这些片段可促进线粒体细胞色素c的释放并逆转细胞凋亡，这代表了一种潜在的治疗机制，尽管触发这种转化的生理条件仍未完全明确。与Bcl-2不同，A1/Bfl-1的过表达不会在转基因小鼠中诱发淋巴瘤，但当与显性失活的p53共表达时，抗泛素化的A1突变体易导致淋巴瘤发生，并加速Myc诱导的淋巴瘤发展；此外，在B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病和急性早幼粒细胞白血病中，A1表达升高与化疗耐药性和不良预后密切相关。

特异性

A1/Bfl-1 Antibody (Rabbit mAb) [N2F22] 可检测内源性 A1/Bfl-1 总蛋白水平。

背景

A1/Bfl-1 (BCL2A1) 是 Bcl-2 蛋白家族的抗凋亡成员，最初在小鼠骨髓中被鉴定为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 诱导基因，主要在造血细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞、T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞）中表达，在肺和血管内皮等非造血组织中的检测有限。 A1/Bfl-1 包含四个 Bcl-2 同源 (BH) 结构域，这些结构域组成八个 α 螺旋，其中 α4、α5 和 α6 螺旋分别对应于 BH3、BH1 和 BH2 结构域，在蛋白表面形成一个疏水沟槽，用于与促凋亡的 Bcl-2 家族成员相互作用。然而，A1 在该结合沟槽的第 78 位氨基酸残基具有独特的酸性谷氨酸残基，这使其相互作用特异性与其他抗凋亡蛋白有所区别。该蛋白在结构上与 Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 和 Mcl-1 的不同之处在于其亲水性 C 端结构域，该结构域缺乏跨膜锚定结构，而是包含泛素化位点，可导致快速的蛋白酶体降解，使其半衰期仅为约 30 分钟，与 Mcl-1 相当，但与 Bcl-2 长达 24 小时的稳定性形成鲜明对比。 A1/Bfl-1 的表达可通过 NF-κB 转录激活迅速诱导，以响应多种炎症刺激，包括 TNF-α、IL-1β、CD40 配体结合、佛波酯、脂多糖以及通过 PLCγ/PKC/NF-κB 通路发挥作用的前 T 细胞受体信号传导，这使得 A1 成为一种即刻早期生存反应基因。该蛋白通过高亲和力结合并中和仅含 BH3 结构域的促凋亡蛋白（包括 Bid、Bim 和 Puma），同时不与 Bad 蛋白结合，从而阻止这些凋亡激活因子触发 Bax/Bak 寡聚化和线粒体外膜通透性增加，否则这些过程将导致细胞色素 c 释放并启动 caspase 依赖性凋亡。 A1/Bfl-1优先与Bak而非Bax相互作用，其直接结合可拮抗Bak介导的细胞死亡。然而，有报道指出，不同物种的A1/Bfl-1存在差异：小鼠A1主要定位于胞质，需要相互作用蛋白才能发挥其抗凋亡作用；而人A1/Bfl-1则优先靶向线粒体。该蛋白在淋巴细胞发育过程中发挥着关键的存活功能——A1表达在DN3向DN4胸腺细胞过渡期达到峰值，此时前TCR信号依赖的A1诱导对于β选择进程是必要且充分的；在CD4+单阳性胸腺细胞中，A1的表达水平比双阳性细胞高30倍；在T细胞受体激活后，外周T细胞中A1与Noxa共同显著上调，从而促进携带高亲和力TCR的抗原特异性克隆的存活。 A1/Bfl-1通过NF-κB激活，在B细胞受体和PLCγ2信号通路下游调控成熟滤泡B细胞的存活，使滤泡B细胞对BCR诱导的细胞凋亡具有抵抗力，从而避免在阴性选择过程中清除过渡性B细胞。系统性红斑狼疮患者的B细胞中A1表达升高，反映了免疫耐受机制的失调。该蛋白通过NF-κB依赖性转录，抑制G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-8和脂多糖刺激引起的自发性细胞凋亡，从而延长中性粒细胞在细菌感染和炎症反应中的存活时间。A1-a亚型的缺失会消除LPS介导的中性粒细胞存活增强作用，但由于代偿性祖细胞活性，稳态和炎症状态下的粒细胞数量仍保持正常。 A1/Bfl-1通过激活NF-κB通路促进巨噬细胞在感染牛分枝杆菌卡介苗、弓形虫和结核分枝杆菌期间的存活，该通路在感染后8至16小时内达到峰值。然而，矛盾的是，A1/Bfl-1抑制毒性结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中自噬体的成熟和酸化，从而阻断自噬介导的杀伤作用和宿主细胞凋亡，使细菌得以在细胞内持续存在。A1与Mcl-1在肥大细胞存活方面具有功能冗余性，二者共同通过维持含有富含组胺的炎症颗粒的组织驻留肥大细胞的存活来介导过敏反应的严重程度。钙蛋白酶可水解切割A1/Bfl-1的N端区域，产生促凋亡的C端片段，这些片段可促进线粒体细胞色素c的释放并逆转细胞凋亡，这代表了一种潜在的治疗机制，尽管触发这种转化的生理条件仍未完全明确。与Bcl-2不同，A1/Bfl-1的过表达不会在转基因小鼠中诱发淋巴瘤，但当与显性失活的p53共表达时，抗泛素化的A1突变体易导致淋巴瘤发生，并加速Myc诱导的淋巴瘤发展；此外，在B细胞慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病和急性早幼粒细胞白血病中，A1表达升高与化疗耐药性和不良预后密切相关。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

18 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-HCL Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (BCL2A1(human) transfected)