ABCA1 Antibody [E4K4] Datasheet

生物描述

特异性	ABCA1 Antibody [E4K4] 可检测内源性 ABCA1 总蛋白水平。
背景	ATP结合盒转运蛋白A1 (ABCA1) 属于ABC转运蛋白超家族，是一种整合膜蛋白，通过ATP依赖的底物跨质膜转运来调节细胞胆固醇和磷脂的稳态。ABCA1包含两个跨膜结构域束，每个结构域束由六个跨膜螺旋组成；两个胞质核苷酸结合结构域负责ATP水解，为转运提供能量；以及一个C端PDZ结构域，该结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，并包含一个对脂质外排活性至关重要的VFVNFA基序。该蛋白通过一个多步骤过程，将胆固醇和磷脂外排至低脂载脂蛋白，主要是载脂蛋白AI (apoA-I) 和载脂蛋白E (apoE)。该过程始于形成富含胆固醇和磷脂的特化细胞表面脂质结构域。载脂蛋白与ABCA1结合会触发构象变化，进而激活多个下游信号通路，包括Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3 (JAK2/STAT3)、蛋白激酶A (PKA)、Rho家族GTP酶CDC42和蛋白激酶C (PKC)，从而使ABCA1既作为脂质转运蛋白又作为信号受体。PKA和CDC42的激活通过调节转运蛋白的构象和膜动力学直接调控ABCA1介导的脂质外排；PKC磷酸化通过减少ABCA1蛋白的降解来稳定其结构；JAK2/STAT3信号通路则控制脂质外排效率和抗炎反应。载脂蛋白A-I (apoA-I) 与 ABCA1 的相互作用可溶解细胞膜胆固醇和磷脂，生成新生高密度脂蛋白 (nHDL) 颗粒。这些颗粒可作为受体，从外周细胞吸收额外的游离胆固醇。随后，卵磷脂：胆固醇酰基转移酶介导的酯化作用将 nHDL 转化为成熟的高密度脂蛋白 (HDL)，后者将胆固醇运输至肝脏，最终通过胆汁分泌和粪便排泄，构成逆向胆固醇转运途径。ABCA1 通过改变细胞膜内脂筏的组成，发挥独立于胆固醇外流的抗炎功能。这种改变会影响 Toll 样受体 4 (TLR4) 信号通路，并降低巨噬细胞中炎症细胞因子和趋化因子的表达，从而将甾醇外流活性与免疫调节作用联系起来。该转运蛋白广泛分布于各种组织中，尤其在脂质周转活跃的肝脏、小肠和脂肪组织中含量丰富。其调控机制包括转录调控（涉及氧固醇激活肝X受体 (LXR)）以及翻译后修饰（包括钙蛋白酶介导的蛋白水解，后者可降解ABCA1蛋白）。ABCA1调节骨骼肌横小管膜胆固醇含量，进而调控胰岛素依赖性GLUT4转位和葡萄糖摄取。ABCA1表达降低会导致胆固醇积累，进而通过降低Akt在Ser473位点的磷酸化水平来损害胰岛素信号传导。 ABCA1基因功能缺失突变会导致唐吉尔病，这是一种常染色体隐性遗传病，其特征是高密度脂蛋白胆固醇水平显著降低、胆固醇酯在组织巨噬细胞中积聚，导致扁桃体肿大呈橙色、肝脾肿大、周围神经病变以及由于胆固醇逆向转运受损而加速的动脉粥样硬化。ABCA1基因变异与晚发性阿尔茨海默病风险相关，ABCA1功能改变可能通过影响细胞胆固醇分布和载脂蛋白E（apoE）脂化状态来影响β-淀粉样蛋白代谢，进而调节淀粉样前体蛋白的加工和Aβ的清除。

特异性

ABCA1 Antibody [E4K4] 可检测内源性 ABCA1 总蛋白水平。

背景

ATP结合盒转运蛋白A1 (ABCA1) 属于ABC转运蛋白超家族，是一种整合膜蛋白，通过ATP依赖的底物跨质膜转运来调节细胞胆固醇和磷脂的稳态。ABCA1包含两个跨膜结构域束，每个结构域束由六个跨膜螺旋组成；两个胞质核苷酸结合结构域负责ATP水解，为转运提供能量；以及一个C端PDZ结构域，该结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，并包含一个对脂质外排活性至关重要的VFVNFA基序。该蛋白通过一个多步骤过程，将胆固醇和磷脂外排至低脂载脂蛋白，主要是载脂蛋白AI (apoA-I) 和载脂蛋白E (apoE)。该过程始于形成富含胆固醇和磷脂的特化细胞表面脂质结构域。载脂蛋白与ABCA1结合会触发构象变化，进而激活多个下游信号通路，包括Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3 (JAK2/STAT3)、蛋白激酶A (PKA)、Rho家族GTP酶CDC42和蛋白激酶C (PKC)，从而使ABCA1既作为脂质转运蛋白又作为信号受体。PKA和CDC42的激活通过调节转运蛋白的构象和膜动力学直接调控ABCA1介导的脂质外排；PKC磷酸化通过减少ABCA1蛋白的降解来稳定其结构；JAK2/STAT3信号通路则控制脂质外排效率和抗炎反应。载脂蛋白A-I (apoA-I) 与 ABCA1 的相互作用可溶解细胞膜胆固醇和磷脂，生成新生高密度脂蛋白 (nHDL) 颗粒。这些颗粒可作为受体，从外周细胞吸收额外的游离胆固醇。随后，卵磷脂：胆固醇酰基转移酶介导的酯化作用将 nHDL 转化为成熟的高密度脂蛋白 (HDL)，后者将胆固醇运输至肝脏，最终通过胆汁分泌和粪便排泄，构成逆向胆固醇转运途径。ABCA1 通过改变细胞膜内脂筏的组成，发挥独立于胆固醇外流的抗炎功能。这种改变会影响 Toll 样受体 4 (TLR4) 信号通路，并降低巨噬细胞中炎症细胞因子和趋化因子的表达，从而将甾醇外流活性与免疫调节作用联系起来。该转运蛋白广泛分布于各种组织中，尤其在脂质周转活跃的肝脏、小肠和脂肪组织中含量丰富。其调控机制包括转录调控（涉及氧固醇激活肝X受体 (LXR)）以及翻译后修饰（包括钙蛋白酶介导的蛋白水解，后者可降解ABCA1蛋白）。ABCA1调节骨骼肌横小管膜胆固醇含量，进而调控胰岛素依赖性GLUT4转位和葡萄糖摄取。ABCA1表达降低会导致胆固醇积累，进而通过降低Akt在Ser473位点的磷酸化水平来损害胰岛素信号传导。 ABCA1基因功能缺失突变会导致唐吉尔病，这是一种常染色体隐性遗传病，其特征是高密度脂蛋白胆固醇水平显著降低、胆固醇酯在组织巨噬细胞中积聚，导致扁桃体肿大呈橙色、肝脾肿大、周围神经病变以及由于胆固醇逆向转运受损而加速的动脉粥样硬化。ABCA1基因变异与晚发性阿尔茨海默病风险相关，ABCA1功能改变可能通过影响细胞胆固醇分布和载脂蛋白E（apoE）脂化状态来影响β-淀粉样蛋白代谢，进而调节淀粉样前体蛋白的加工和Aβ的清除。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

254 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HepG2, Lane 2: U-87 MG