ACE2 Antibody (Rabbit mAb) [P24F5]

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生物描述

特异性 ACE2 Antibody (Rabbit mAb) [P24F5] 可检测内源性 ACE2 总蛋白水平。
背景 血管紧张素转换酶2 (ACE2) 是一种I型整合膜锌羧肽酶，属于M2肽酶家族，它通过切割血管紧张素肽的单个C端残基，生成具有血管舒张和抗增殖特性的产物，从而作为肾素-血管紧张素系统的拮抗调节成分发挥作用。其胞外结构域包含一个球状金属肽酶结构域，该结构域具有典型的HEMGH锌结合基序和一个可容纳血管紧张素II和血管紧张素I的底物结合槽；而其胞质尾部则包含线性相互作用基序和一个跨膜区段，该区段将ACE2锚定在内皮细胞和上皮细胞的质膜上。催化活性可将血管紧张素II转化为血管紧张素1-7，将血管紧张素I转化为血管紧张素1-9，从而降低血管收缩剂血管紧张素II的水平，并提高通过Mas受体及相关通路发出信号的肽类水平，促进心血管和肾脏系统的血管舒张、利钠、抗增殖信号传导以及抗纤维化和抗炎作用。除血管紧张素底物外，ACE2还能高效水解包括apelin-13、强啡肽A(1-13)和去精氨酸缓激肽在内的多种肽类，这使得该酶与其他血管活性肽、阿片类肽和炎症肽网络相连，尽管这些活性的生理影响因组织环境而异。 ACE2在血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞以及睾丸间质细胞和支持细胞中高表达，并延伸至呼吸道和胃肠道上皮细胞。在这些组织中，ACE2调节局部肾素-血管紧张素系统的平衡，并参与血压、心脏功能、肾脏稳态以及男性生育能力的调节。ACE2的胞外结构域易受ADAM17等金属蛋白酶的水解，释放出可溶性且具有催化活性的形式进入血液循环和组织间液；而膜内保留的片段则参与信号通路的串扰。因此，蛋白水解过程动态地调节ACE2的表面表达水平以及全身和局部肽段的加工。 ACE2是严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV和SARS-CoV-2以及人冠状病毒NL63的入侵受体。病毒刺突蛋白与ACE2胞外结构域的高亲和力结合促进病毒-受体复合物的网格蛋白依赖性内吞作用，并同时导致ACE2从细胞表面内化和下调。心血管组织中膜ACE2的缺失或活性降低会增强血管紧张素II通过AT1受体的信号传导，增加ERK和NF-κB通路的激活，并促进血管收缩、肥大、氧化应激和炎症；而ACE2表达的维持或增强则会将信号传导转向血管紧张素1-7-Mas通路，从而支持内皮功能和心脏保护。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 1:100 - 1:400
反应性 Human, Mouse, Hamster
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 93 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (hACE2 transfected)