Akt3 Antibody (Rabbit mAb) [C10D18] Datasheet

生物描述

特异性	Akt3 Antibody (Rabbit mAb) [C10D18] 可检测内源性 Akt3 总蛋白水平。
背景	Akt3（RAC-γ丝氨酸/苏氨酸激酶）是Akt/PKB家族AGC激酶的成员，作为PI3K信号通路的关键效应分子，在脑、肾和心脏中优先表达和活性，并以组织选择性的方式参与调控生长、代谢、存活和炎症反应。该激酶与Akt亚型具有保守的结构域组成，包括一个结合磷脂酰肌醇的N端pleckstrin同源结构域、一个包含激活环苏氨酸位点（对应于Akt3中的Thr305）的中央激酶结构域以及一个包含Ser472的C端疏水基序。这两个调控位点的磷酸化协同作用，在PI3K产生的PIP3和PDK1/mTORC2信号通路激活后，产生完整的催化活性。 Akt3在受体酪氨酸激酶、细胞因子受体、G蛋白偶联受体（GPCR）或激活I类PI3K的抗原受体受到刺激后被募集到细胞膜上。膜定位使得PDK1能够磷酸化其激活环，mTORC2能够磷酸化其疏水基序。同时，PTEN、PP2A和PHLPP等磷酸酶抑制这一激活循环，并设定下游反应的信号阈值。Akt3与Akt1和Akt2共享许多底物，包括凋亡、细胞周期进程、代谢和mTORC1的调节因子。Akt3还能磷酸化控制TSC1/TSC2复合物活性、mTORC1输出、GSK3依赖的细胞周期蛋白D1和糖原合成调控以及FoxO转录因子的蛋白质，从而将生长因子和营养物质的可用性与生物合成、增殖和存活联系起来。 Akt3 还表现出亚型偏向性功能：在神经组织中高表达和信号活性支持大脑生长和神经元存活，而 Akt3 活性的破坏或降低则与脑容量减少和神经发育表型相关。此外，在雌激素受体阴性乳腺癌、PTEN 缺陷型前列腺癌和其他恶性肿瘤中，Akt3 信号增强有助于肿瘤细胞的存活和增殖，在这些肿瘤中，Akt3 通常是主要的活性 Akt 亚型。在免疫和炎症环境中，Akt3 调节炎症性脱髓鞘疾病和脂肪组织扩张等反应，其活性影响增殖、分化和炎症信号之间的平衡，从而发挥与 Akt1 和 Akt2 部分不同的疾病特异性作用，这使得 Akt3 成为肿瘤学、神经病学和代谢疾病中潜在的亚型选择性靶点。

特异性

Akt3 Antibody (Rabbit mAb) [C10D18] 可检测内源性 Akt3 总蛋白水平。

背景

Akt3（RAC-γ丝氨酸/苏氨酸激酶）是Akt/PKB家族AGC激酶的成员，作为PI3K信号通路的关键效应分子，在脑、肾和心脏中优先表达和活性，并以组织选择性的方式参与调控生长、代谢、存活和炎症反应。该激酶与Akt亚型具有保守的结构域组成，包括一个结合磷脂酰肌醇的N端pleckstrin同源结构域、一个包含激活环苏氨酸位点（对应于Akt3中的Thr305）的中央激酶结构域以及一个包含Ser472的C端疏水基序。这两个调控位点的磷酸化协同作用，在PI3K产生的PIP3和PDK1/mTORC2信号通路激活后，产生完整的催化活性。 Akt3在受体酪氨酸激酶、细胞因子受体、G蛋白偶联受体（GPCR）或激活I类PI3K的抗原受体受到刺激后被募集到细胞膜上。膜定位使得PDK1能够磷酸化其激活环，mTORC2能够磷酸化其疏水基序。同时，PTEN、PP2A和PHLPP等磷酸酶抑制这一激活循环，并设定下游反应的信号阈值。Akt3与Akt1和Akt2共享许多底物，包括凋亡、细胞周期进程、代谢和mTORC1的调节因子。Akt3还能磷酸化控制TSC1/TSC2复合物活性、mTORC1输出、GSK3依赖的细胞周期蛋白D1和糖原合成调控以及FoxO转录因子的蛋白质，从而将生长因子和营养物质的可用性与生物合成、增殖和存活联系起来。 Akt3 还表现出亚型偏向性功能：在神经组织中高表达和信号活性支持大脑生长和神经元存活，而 Akt3 活性的破坏或降低则与脑容量减少和神经发育表型相关。此外，在雌激素受体阴性乳腺癌、PTEN 缺陷型前列腺癌和其他恶性肿瘤中，Akt3 信号增强有助于肿瘤细胞的存活和增殖，在这些肿瘤中，Akt3 通常是主要的活性 Akt 亚型。在免疫和炎症环境中，Akt3 调节炎症性脱髓鞘疾病和脂肪组织扩张等反应，其活性影响增殖、分化和炎症信号之间的平衡，从而发挥与 Akt1 和 Akt2 部分不同的疾病特异性作用，这使得 Akt3 成为肿瘤学、神经病学和代谢疾病中潜在的亚型选择性靶点。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

56 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: AKT1 proteins, Lane 2: AKT2 proteins, Lane 3: AKT3 proteins