α-Skeletal Muscle Actin Antibody (Rabbit mAb) [A24H10]

目录号：F5510

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生物描述

特异性 α-Skeletal Muscle Actin Antibody (Rabbit mAb) [A24H10] 可检测内源性 α-Skeletal Muscle Actin 总蛋白水平。
背景 由ACTA1基因编码的α-骨骼肌肌动蛋白属于高度保守的肌动蛋白家族，构成成年骨骼肌肌节细丝的结构核心。在细丝中，α-肌动蛋白聚合形成双螺旋丝，作为收缩周期中肌球蛋白的结合轨道。肌肉收缩力的产生依赖于肌球蛋白马达头从粗丝延伸出来，并周期性地附着于细丝上的肌动蛋白结合位点。肌球蛋白与这些结合位点的结合并非由肌动蛋白单独作用，而是由肌钙蛋白和原肌球蛋白等调节蛋白共同调控。在低钙浓度下，肌钙蛋白I将原肌球蛋白固定在肌动蛋白表面的抑制位置，从而在空间上阻碍肌球蛋白的结合。钙离子与肌钙蛋白C结合后，会将肌钙蛋白I从原肌球蛋白上拉开，使原肌球蛋白能够围绕肌动蛋白丝上相对固定的点旋转，而不是在其上滚动或滑动。这种重新定位部分暴露了肌球蛋白的结合位点，并允许肌球蛋白头部与肌动蛋白进行初始的弱结合。这些弱结合的横桥随后转变为强结合的、产生力的构型，完全激活细丝，完成钙触发的从松弛到收缩的转换。肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物在肌动蛋白表面的重新构型是连接钙信号和机械力输出的核心机制事件。 ACTA1基因的点突变直接破坏肌动蛋白-肌球蛋白界面处的循环：与线状肌病相关的Asp286Gly突变会改变肌丝内的肌动蛋白-肌动蛋白界面，阻止肌球蛋白横桥正常转变为强结合状态，从而起到毒蛋白的作用，限制了能够产生力的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的比例，并在单根透化肌纤维水平上导致可测量的肌肉无力。ACTA1基因突变已被证实是多种先天性肌病的病因，包括线状肌病、核内棒状肌病和肌动蛋白丝聚集体肌病。这些组织病理学表现的多样性反映了突变肌动蛋白单体破坏肌丝组装、肌动蛋白-肌动蛋白堆积或肌球蛋白结合的多种方式，但并非完全阻止其整合到肌节中。由于突变肌动蛋白通常与野生型肌动蛋白一起整合到同一细丝中，因此由此产生的功能缺陷取决于每个变体的具体结构后果，这使得 ACTA1 成为一个靶点，其中基因型-表型相关性、横桥动力学和细丝激活机制与理解疾病严重程度以及评估旨在恢复肌动蛋白-肌球蛋白正确结合的候选治疗策略直接相关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:5000 1:100
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 42 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse skeletal muscle, Lane 2: Rat skeletal muscle