Amyloid Precursor Protein Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Amyloid Precursor Protein Rabbit mAb 用于检测内源性 Amyloid Precursor Protein 总的蛋白水平。
背景	淀粉样前体蛋白（APP）是一种I型跨膜糖蛋白，主要在大脑中表达，集中于神经元突触，参与关键的细胞功能，包括突触发生、神经元生长、突触可塑性和存活。APP由一个大的胞外N端结构域组成，包含如生长因子样结构域（GFLD）和铜结合结构域（CuBD）等子结构，一个单一的跨膜α-螺旋和一个包含保守基序（如YENPTY）用于细胞内信号转导和运输的短胞内C端结构域。APP通过α、β和γ分泌酶进行蛋白水解加工，产生具有不同生物学作用的各种片段。非淀粉样途径生成可溶性APPα（sAPPα），促进神经突起生长和突触功能，而淀粉样途径生成与阿尔茨海默病（AD）相关的淀粉样β（Aβ）肽。Aβ肽聚集成斑块，破坏神经元通信并引发神经退行性病变。相反，APP胞内结构域（AICD）与Fe65和Tip60等适配蛋白相互作用，调节转录和细胞信号转导。异构体的多样性，例如在神经元中的APP695，进一步影响其生理和病理作用。APP基因的突变可以增加Aβ的产生或改变APP的加工过程，导致家族性AD，而如A673T等保护性突变则减少Aβ的形成。APP的胞外结构域介导与配体和基质蛋白的相互作用，影响突触粘附和神经修复。

特异性

Amyloid Precursor Protein Rabbit mAb 用于检测内源性 Amyloid Precursor Protein 总的蛋白水平。

背景

淀粉样前体蛋白（APP）是一种I型跨膜糖蛋白，主要在大脑中表达，集中于神经元突触，参与关键的细胞功能，包括突触发生、神经元生长、突触可塑性和存活。APP由一个大的胞外N端结构域组成，包含如生长因子样结构域（GFLD）和铜结合结构域（CuBD）等子结构，一个单一的跨膜α-螺旋和一个包含保守基序（如YENPTY）用于细胞内信号转导和运输的短胞内C端结构域。APP通过α、β和γ分泌酶进行蛋白水解加工，产生具有不同生物学作用的各种片段。非淀粉样途径生成可溶性APPα（sAPPα），促进神经突起生长和突触功能，而淀粉样途径生成与阿尔茨海默病（AD）相关的淀粉样β（Aβ）肽。Aβ肽聚集成斑块，破坏神经元通信并引发神经退行性病变。相反，APP胞内结构域（AICD）与Fe65和Tip60等适配蛋白相互作用，调节转录和细胞信号转导。异构体的多样性，例如在神经元中的APP695，进一步影响其生理和病理作用。APP基因的突变可以增加Aβ的产生或改变APP的加工过程，导致家族性AD，而如A673T等保护性突变则减少Aβ的形成。APP的胞外结构域介导与配体和基质蛋白的相互作用，影响突触粘附和神经修复。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC, IF

稀释比例

WB	IP	IHC	IF
1:20000	1:30	1:500	1:500

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit

MW

86 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:20000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:20000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Zheng, H, et al. Mol Neurodegeneration 6, 27 (2011).

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa
Lane 2: HEK293
Lane 3: Mouse brain
Lane 4: Rat brain