Anti-Eps15 Rabbit Antibody [D10D13]

目录号：F1282

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生物描述

特异性

Anti-Eps15 Rabbit Antibody [D10D13] 可识别内源性 Eps15 总蛋白水平。根据序列比对，该抗体预测与 Eps15a 和 Eps15b 均发生反应。该抗体不与 Eps15R 发生交叉反应。
背景

Eps15（EGFR 通路底物 15）最初被确定为 EGFR 激酶活性的底物。它具有三部分结构，包括具有三个 EH 结构域的 NH2 末端部分、中央假定的卷曲螺旋区域和具有多个天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸三联体的 COOH 末端结构域。 Eps15 位于网格蛋白小窝，与网格蛋白组装复合物 AP-2 和 AP-2 结合蛋白 Epsin 相互作用。破坏 Eps15 和 Epsin 的功能会抑制 EGF 和转​​铁蛋白的受体介导内吞作用，表明它们在内吞机制中发挥作用，包括突触囊泡膜内吞作用。如电子显微镜所示，Eps15 与 AP-2、Synaptojanin1 和 Epsin 结合，与质膜网格蛋白小窝和囊泡共定位，并位于出芽小窝的边缘。微注射抗 Eps15 抗体可抑制 EGF 和转​​铁蛋白的内化，而 Eps15 的 COOH 末端区域 (aa 529-897) 的过度表达通过阻止 Eps15 与 AP-2 复合物结合，充当内吞作用的显性负抑制剂。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:100 1:200
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey, Chicken, Xenopus, Dog, Horse
抗体类型 Rabbit MW 138 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃
储存条件
(自收到货起)		 –20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela
    Lane 2: A431
    Lane 3: A172
    Lane 4: HCT-15
    Lane 5: NCI-H226
    Lane 6: T-470
    Lane 7: MCF7
    Lane 8: CCRF-CEM
    Lane 9: SR