Anti-Phospho-Rpb1 CTD (Ser7) Rabbit Antibody [C17G21] Datasheet

生物描述

特异性	Anti-Phospho-Rpb1 CTD (Ser7) Rabbit Antibody [C17G21] 仅识别羧基末端结构域 (CTD) 七肽重复序列 [Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6、Ser7] 在 Ser7 位点磷酸化时的内源性 Rpb1 蛋白水平。
背景	RNA 聚合酶 II (RNAPII) 是一种大型多亚基酶，可作为 DNA 依赖性 RNA 聚合酶发挥作用，利用四种核糖核苷三磷酸作为底物，促进 DNA 转录为 RNA。最大的亚基称为 Rpb1 或 POLR2A，具有独特的七肽序列 (Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6、Ser7)，其羧基末端结构域 (CTD) 重复最多 52 次。这些七肽重复序列会受到各种翻译后修饰的影响，这些修饰在调控 RNAPII 复合物的活性方面起着关键作用。在主动转录过程中，CTD 的磷酸化对于将转录与染色质重塑和 RNA 加工联系起来至关重要。这种修饰控制染色质修饰酶和 RNA 加工蛋白向转录基因的募集。最初，RNAPII 在转录启动阶段，它通过与 DNA 结合转录因子和介导复合物的相互作用导向基因启动子。Ser7 的磷酸化对于小核 RNA (snRNA) 基因的有效转录尤为重要。CDK7 在转录早期阶段对 Ser7 的磷酸化有助于募集 RPAP2，后者随后使 Ser5 去磷酸化。该过程导致 Ser2/Ser7 的双磷酸化模式，从而增强整合复合物的结合，从而促进新生 snRNA 转录本的处理。

特异性

Anti-Phospho-Rpb1 CTD (Ser7) Rabbit Antibody [C17G21] 仅识别羧基末端结构域 (CTD) 七肽重复序列 [Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6、Ser7] 在 Ser7 位点磷酸化时的内源性 Rpb1 蛋白水平。

背景

RNA 聚合酶 II (RNAPII) 是一种大型多亚基酶，可作为 DNA 依赖性 RNA 聚合酶发挥作用，利用四种核糖核苷三磷酸作为底物，促进 DNA 转录为 RNA。最大的亚基称为 Rpb1 或 POLR2A，具有独特的七肽序列 (Tyr1、Ser2、Pro3、Thr4、Ser5、Pro6、Ser7)，其羧基末端结构域 (CTD) 重复最多 52 次。这些七肽重复序列会受到各种翻译后修饰的影响，这些修饰在调控 RNAPII 复合物的活性方面起着关键作用。在主动转录过程中，CTD 的磷酸化对于将转录与染色质重塑和 RNA 加工联系起来至关重要。这种修饰控制染色质修饰酶和 RNA 加工蛋白向转录基因的募集。最初，RNAPII 在转录启动阶段，它通过与 DNA 结合转录因子和介导复合物的相互作用导向基因启动子。Ser7 的磷酸化对于小核 RNA (snRNA) 基因的有效转录尤为重要。CDK7 在转录早期阶段对 Ser7 的磷酸化有助于募集 RPAP2，后者随后使 Ser5 去磷酸化。该过程导致 Ser2/Ser7 的双磷酸化模式，从而增强整合复合物的结合，从而促进新生 snRNA 转录本的处理。

使用信息

抗体应用

WB, IP, ChIP

稀释比例

WB	IP	CHIP
1:1000	1:100	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit

MW

250 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela
Lane 2: 293T
Lane 3: C2C12
Lane 4: H-4-II-E