AS160 Antibody [L14F10] Datasheet

生物描述

特异性	AS160 Antibody [L14F10] 可检测内源性AS160 (L14F10) 总蛋白水平。
背景	AS160（也称为TBC1D4）是一个160 kDa的Akt底物和Rab GTPase活化蛋白（Rab-GAP），它通过控制脂肪细胞和肌肉细胞中GLUT4的易位，在调节胰岛素刺激的葡萄糖摄取中起着至关重要的作用。AS160包含一个Rab-GAP结构域、两个磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域和一个钙调蛋白结合结构域，后者介导肌肉中不依赖磷酸化的葡萄糖摄取。在没有胰岛素的情况下，非磷酸化的AS160会与GLUT4储存囊泡（GSV）结合，并抑制其向质膜移动，从而限制葡萄糖进入。在胰岛素刺激下，Akt会在关键位点磷酸化AS160，抑制其GAP活性，并使Rab（例如RAB2A、RAB8A、RAB10和RAB14）保持其活性GTP结合状态。这促进了GLUT4囊泡与质膜的融合，从而促进葡萄糖的吸收。此外，第二个PTB结构域包含一个磷脂结合区，将AS160靶向质膜，而另一个单独的结构域介导与GSV货物的结合，强调了其在葡萄糖调节中的多功能作用。编码AS160的基因（TBC1D4）产生两种异构体：一种长异构体主要存在于骨骼肌和心肌中，另一种短异构体组织分布更广泛。AS160作为调节开关的作用因其参与GLUT4囊泡的对接和融合步骤而得到进一步强调，在这些步骤中，磷酸化将其从GLUT4易位的抑制剂转化为促进剂。AS160的突变或失调会损害胰岛素刺激的葡萄糖吸收，导致胰岛素抵抗和代谢疾病。

特异性

AS160 Antibody [L14F10] 可检测内源性AS160 (L14F10) 总蛋白水平。

背景

AS160（也称为TBC1D4）是一个160 kDa的Akt底物和Rab GTPase活化蛋白（Rab-GAP），它通过控制脂肪细胞和肌肉细胞中GLUT4的易位，在调节胰岛素刺激的葡萄糖摄取中起着至关重要的作用。AS160包含一个Rab-GAP结构域、两个磷酸酪氨酸结合（PTB）结构域和一个钙调蛋白结合结构域，后者介导肌肉中不依赖磷酸化的葡萄糖摄取。在没有胰岛素的情况下，非磷酸化的AS160会与GLUT4储存囊泡（GSV）结合，并抑制其向质膜移动，从而限制葡萄糖进入。在胰岛素刺激下，Akt会在关键位点磷酸化AS160，抑制其GAP活性，并使Rab（例如RAB2A、RAB8A、RAB10和RAB14）保持其活性GTP结合状态。这促进了GLUT4囊泡与质膜的融合，从而促进葡萄糖的吸收。此外，第二个PTB结构域包含一个磷脂结合区，将AS160靶向质膜，而另一个单独的结构域介导与GSV货物的结合，强调了其在葡萄糖调节中的多功能作用。编码AS160的基因（TBC1D4）产生两种异构体：一种长异构体主要存在于骨骼肌和心肌中，另一种短异构体组织分布更广泛。AS160作为调节开关的作用因其参与GLUT4囊泡的对接和融合步骤而得到进一步强调，在这些步骤中，磷酸化将其从GLUT4易位的抑制剂转化为促进剂。AS160的突变或失调会损害胰岛素刺激的葡萄糖吸收，导致胰岛素抵抗和代谢疾病。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:30

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

146 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: HEK-293, Lane 3: RAW 264.7, Lane 4: PC-12