BAF57/SMARCE1 Antibody (Rabbit mAb) [B6L12]

目录号：F5650

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生物描述

特异性 BAF57/SMARCE1 Antibody (Rabbit mAb) [B6L12] 可检测内源性 BAF57/SMARCE1 总蛋白水平。
背景 BAF57由SMARCE1基因编码，是哺乳动物SWI/SNF (BAF) ATP依赖性染色质重塑复合物的核心亚基。该复合物通过重新定位或破坏核小体来调节转录因子与DNA的结合，从而发挥基因转录的关键调控作用。BAF57蛋白包含一个HMG-box DNA结合域，该结构域能够识别扭曲或四向连接的DNA，并与核小体和连接区结合，使BAF57成为一个模块化的界面，将染色质结构与序列特异性转录因子和信号输入连接起来。在SWI/SNF复合物中，BAF57参与控制细胞周期进程、增殖和分化的基因调控程序，并通过选择性地整合到响应发育和环境信号的BAF复合物中发挥组织特异性功能。在乳腺癌细胞中，BAF57 与雌激素受体α (ERα) 直接相互作用，其特定结构域结合 ERα 铰链区，促进 SWI/SNF 复合物募集至 ERα 靶启动子，从而增强染色质重塑和雌激素反应基因的转录，并支持雌激素刺激的细胞增殖。在这些细胞中，BAF57 表达或功能的破坏会降低多种内源性 ER 靶基因的表达，并阻断雌激素驱动的细胞周期进程，表明 SMARCE1 是一种关键的染色质相关辅助因子，它将核激素受体信号传导与 ATP 依赖的核小体重塑相偶联。除了激素信号传导外，SMARCE1 还通过涉及 HIF1A 和 PTK2 (FAK) 的通路影响乳腺癌细胞的转移行为：SMARCE1 的缺失或减少会改变 SWI/SNF 复合物的占位以及 HIF1A 反应基因和 PTK2 调控的黏附和迁移机制的转录调控，从而导致细胞运动性、侵袭性和转移潜能的改变。同一项研究表明，SMARCE1 水平的调节会重编程与缺氧信号传导、黏着斑动力学和细胞骨架组织相关的基因表达网络，使 BAF57 的功能与肿瘤细胞中微环境应激、染色质状态和侵袭行为的整合相一致。在斑马鱼模型中，SMARCE1 的发育作用也显而易见，其中 smarce1 突变体表现出心内膜形态发生缺陷和心脏转录因子表达改变，这与含有 BAF57 的 SWI/SNF 复合物指导组织特异性转录程序以调控器官形成和维持谱系特性的观点相一致。在结构层面，BAF57 将其 HMG 盒嵌入一个多结构域支架中，该支架参与与其他 BAF 亚基和转录调控因子的蛋白质-蛋白质相互作用，从而组装不同的 SWI/SNF 变体，并促进亚基组合使用，而这种组合使用是依赖于特定环境的染色质重塑的基础。在功能层面，SMARCE1 位于染色质重塑、核受体信号传导、缺氧响应性转录和发育程序的交汇点，因此围绕该靶点的实验设计通常侧重于其在组装特定 BAF 复合物、将其募集到调控位点以及改变可及性和转录因子占有率方面的作用，而不是其催化活性本身。 SMARCE1的种系和体细胞改变与肿瘤和非肿瘤病理相关：在透明细胞脑膜瘤和其他疾病中均有SMARCE1功能缺失突变的报道，这支持了BAF57剂量在控制染色质肿瘤抑制通路中的作用；而在乳腺癌和子宫内膜癌中，SMARCE1的异常表达或高表达与更具侵袭性的临床和病理特征相关。在炎症和神经退行性疾病中，异常的BAF57活性被认为是一种生物标志物和机制性因素，反映了其调节免疫调节、神经元基因表达和应激反应等转录程序的能力，其中SWI/SNF复合物的组成和SMARCE1的状态会影响与疾病相关的基因网络。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IP IHC IF FCM
1:1000 - 1:10000 1:10 - 1:100 1:250 - 1:500 1:250 - 1:500 1:10 - 1:100
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 47 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: MCF7, Lane 2: HeLa, Lane 3: Jurkat, Lane 4: Raji