BAFF Antibody (Rabbit mAb) [J1C19]

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生物描述

特异性 BAFF Antibody (Rabbit mAb) [J1C19] 可检测内源性 BAFF 总蛋白水平。
背景 BAFF，又称B淋巴细胞刺激因子，其分子编号为TNFSF13B，属于肿瘤坏死因子配体家族，可与B细胞上的三种不同受体结合：BAFF-R、TACI和BCMA。这三种受体均为III型跨膜蛋白，与其他TNF受体家族成员不同，它们缺乏典型的信号肽，而是共享一个结构保守的β发夹结构域，该结构域控制配体结合。BAFF通常以典型的同源三聚体形式存在，但部分BAFF也能通过位于单个亚基两个β折叠链之间的异常长的环状结构，自组装成一个更大的六十亚基复合物，其结构相当于二十个堆叠的三聚体。这种寡聚状态受pH值直接调控：在pH 6.0时，BAFF完全以三聚体形式存在；而在pH 7.4时，则完全转化为六十亚基复合物。这种寡聚状态发挥着受体选择性信号开关的作用，而不仅仅是一种高亲和力的配体形式：BAFF-R 对 BAFF 的三聚体和六十聚体形式均有有效反应，而成熟 B 细胞和浆母细胞中的 TACI 信号传导几乎完全由六十聚体实现，尽管三聚体在直接结合实验中与 TACI 的亲和力相当，但其活性却低约一千倍，这表明 TACI 的激活需要六十聚体的高阶聚集能力来募集和交联足够的 TRAF 衔接蛋白，从而实现有效的下游信号传导。具体而言，在 BAFF-R 的下游，配体结合会将 TRAF3 募集到受体上，这种募集会触发 TRAF3 自身的蛋白酶体降解，从而释放 NF-κB 诱导激酶 NIK，使其不再处于未受刺激状态下由 TRAF3 介导的组成型降解状态；稳定的NIK随后激活非经典NF-κB2通路，驱动NF-κB2 p52/RelB异二聚体入核，从而支持B细胞存活基因的转录。该非经典通路与BAFF受体结合下游的其他存活机制并行运作，包括上调抗凋亡的Bcl-2家族成员、降解促凋亡蛋白Bim以及改变蛋白激酶Cδ的亚细胞定位。由于BCMA和TACI还能结合BAFF相关配体APRIL，且BCMA对APRIL的亲和力高于对BAFF的亲和力，而TACI对两种配体的结合能力相当，因此BAFF-BAFF-R-TACI-BCMA受体网络将两种相关但结构不同的配体整合到B细胞发育不同阶段的重叠存活信号中。 BAFF 通过该受体网络的过量信号传导可维持自身反应性 B 细胞的存活，并与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎有关，临床上利用中和 BAFF 的治疗性抗体来减少这些自身免疫性疾病中的致病性 B 细胞群。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:500-1:1000 1:30 1:100 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 31 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: U937