BMP-1/PCP Antibody (Rat mAb) [D9N3] Datasheet

生物描述

特异性	BMP-1/PCP Antibody (Rat mAb) [D9N3] 可检测内源性 BMP-1/PCP 总蛋白水平。
背景	BMP-1，又称前胶原C肽蛋白酶（PCP），是一种分泌型锌依赖性金属蛋白酶，属于星蛋白酶家族，是典型的I型前胶原C肽蛋白酶，也是细胞外基质组装的关键调节因子。该蛋白以多结构域前体的形式合成，其N端包含信号肽和前结构域，随后是星蛋白酶样催化结构域以及多个CUB和EGF样模块。前结构域经弗林蛋白酶样前蛋白转化酶去除后，生成活性酶，该酶与细胞表面和细胞周围间隙的基质成分结合。BMP-1/PCP可切割纤维状I、II和III型前胶原的C端前肽，并加工V型前胶原的C端结构域，生成成熟的胶原分子，这些分子可组装成结构正确的纤维，从而直接控制胶原纤维形成的效率和质量。除了前胶原蛋白外，BMP-1 还作用于更广泛的细胞外前体蛋白，包括大聚糖、层粘连蛋白-5、牙本质基质蛋白-1 和赖氨酰氧化酶的前体，这些蛋白将 BMP-1 的活性与蛋白聚糖、基底膜网络、矿化基质成分和胶原交联酶的成熟联系起来。通过这种底物谱，BMP-1 将蛋白水解加工与细胞外基质完整结构和功能特性的获得相偶联，从而影响基质刚度、纤维组织以及组织承受机械负荷、支持矿物质沉积或提供细胞粘附支架的能力。BMP-1 属于由 BMP1 基因座编码的一小群相关蛋白酶，这些蛋白酶产生几种具有不同 C 端结构域组成的亚型，这些亚型在底物偏好性、组织分布和辅助因子相互作用方面表现出差异，从而可以对细胞外基质加工进行组织特异性调控。该酶与前胶原C端内肽酶增强蛋白（PCPEs）发生功能性相互作用，后者结合前胶原底物并提高BMP-1介导的C端切割效率，从而提供额外的调控层，根据基质环境调节前胶原的加工。BMP-1活性通过确保胶原基质的适当成熟和组装来促进骨骼和软骨的形成，这些胶原基质支持成骨细胞和软骨细胞的功能。BMP-1依赖性加工还影响细胞外基质（ECM）中生长因子通路（包括某些TGF-β相关成分）的激活。BMP-1表达或活性的失调与结缔组织异常、纤维化重塑和骨修复受损有关，这反映了该蛋白酶在协调胶原加工、交联酶激活以及整合细胞外基质的结构和信号功能方面的核心地位。

特异性

BMP-1/PCP Antibody (Rat mAb) [D9N3] 可检测内源性 BMP-1/PCP 总蛋白水平。

背景

BMP-1，又称前胶原C肽蛋白酶（PCP），是一种分泌型锌依赖性金属蛋白酶，属于星蛋白酶家族，是典型的I型前胶原C肽蛋白酶，也是细胞外基质组装的关键调节因子。该蛋白以多结构域前体的形式合成，其N端包含信号肽和前结构域，随后是星蛋白酶样催化结构域以及多个CUB和EGF样模块。前结构域经弗林蛋白酶样前蛋白转化酶去除后，生成活性酶，该酶与细胞表面和细胞周围间隙的基质成分结合。BMP-1/PCP可切割纤维状I、II和III型前胶原的C端前肽，并加工V型前胶原的C端结构域，生成成熟的胶原分子，这些分子可组装成结构正确的纤维，从而直接控制胶原纤维形成的效率和质量。除了前胶原蛋白外，BMP-1 还作用于更广泛的细胞外前体蛋白，包括大聚糖、层粘连蛋白-5、牙本质基质蛋白-1 和赖氨酰氧化酶的前体，这些蛋白将 BMP-1 的活性与蛋白聚糖、基底膜网络、矿化基质成分和胶原交联酶的成熟联系起来。通过这种底物谱，BMP-1 将蛋白水解加工与细胞外基质完整结构和功能特性的获得相偶联，从而影响基质刚度、纤维组织以及组织承受机械负荷、支持矿物质沉积或提供细胞粘附支架的能力。BMP-1 属于由 BMP1 基因座编码的一小群相关蛋白酶，这些蛋白酶产生几种具有不同 C 端结构域组成的亚型，这些亚型在底物偏好性、组织分布和辅助因子相互作用方面表现出差异，从而可以对细胞外基质加工进行组织特异性调控。该酶与前胶原C端内肽酶增强蛋白（PCPEs）发生功能性相互作用，后者结合前胶原底物并提高BMP-1介导的C端切割效率，从而提供额外的调控层，根据基质环境调节前胶原的加工。BMP-1活性通过确保胶原基质的适当成熟和组装来促进骨骼和软骨的形成，这些胶原基质支持成骨细胞和软骨细胞的功能。BMP-1依赖性加工还影响细胞外基质（ECM）中生长因子通路（包括某些TGF-β相关成分）的激活。BMP-1表达或活性的失调与结缔组织异常、纤维化重塑和骨修复受损有关，这反映了该蛋白酶在协调胶原加工、交联酶激活以及整合细胞外基质的结构和信号功能方面的核心地位。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:500	1:40

反应性

Human

抗体类型

Rat Monoclonal Antibody

MW

111 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:250），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:250），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (hBMP1 transfected)