Brachyury/Bry Antibody (Rabbit mAb) [K13E20]

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生物描述

特异性 Brachyury/Bry Antibody (Rabbit mAb) [K13E20] 可检测内源性 Brachyury/Bry 总蛋白水平。
背景 Brachyury 由 T 基因编码，是 T-box 转录因子家族的创始成员，也是脊椎动物原肠胚形成过程中后部中胚层形成和轴向发育的关键调控因子。它在原始条纹衍生的新生和迁移的中胚层细胞中的瞬时表达，定义了轴向和近轴中胚层谱系，并协调产生脊索和前肢尾侧结构的形态发生运动。该蛋白包含一个保守的 T-box DNA 结合域，该域采用与免疫球蛋白折叠相关的七链 β-桶状结构，并插入 α-螺旋，形成一个复合表面，该表面主要识别小沟中高度保守的回文共有序列；结构分析表明，Brachyury 通过特定 β 链环和螺旋之间的接触在 DNA 上二聚化，并且二聚体界面和 DNA 接触残基经过调整，可以结合和调节靶基因的增强子，例如成纤维细胞生长因子 4 (FGF4/eFGF) 和 Brachyury 诱导的同源框 (Bix) 基因，这使得 Brachyury 处于控制中胚层分化的基因调控模块的头部。小鼠的遗传学研究表明，纯合 T 突变体在妊娠中期死亡，中胚层细胞在原条处积聚，后部中胚层丢失，脊索异常，证实 Brachyury 是中胚层分化、上皮-间质转化以及驱动轴向延伸的迁移行为所必需的，而 Brachyury mRNA 的过表达足以诱导中胚层特征并上调 eFGF，将其转录活性直接与 FGF 信号通路联系起来。利用全基因组占位和表达谱分析，绘制了小鼠早期胚胎发生过程中 Brachyury 介导的发育通路图，结果表明 Brachyury 结合于参与 Wnt、FGF、TGF-β 和 BMP 信号通路以及细胞骨架动力学的基因附近的增强子，并且其靶基因将沿前后轴的位置信息与细胞运动程序整合起来，从而确立了 Brachyury 作为连接形态发生素梯度与中胚层命运和胚层模式形成的网络中的核心节点的地位。在人类中，T 在脊索和成人脊索瘤中表达，Brachyury 蛋白是脊索来源肿瘤的高度特异性诊断标志物；等位基因关联研究发现，人类T基因中存在一个常见的内含子多态性（TIVS7-2），该多态性与脊柱裂存在显著的传递不平衡。来自英国和荷兰家庭的综合数据支持该T等位基因与神经管缺陷易感性之间存在微弱但可重复的关联，表明Brachyury基因的变异与多因素神经管缺陷风险相关，但并非唯一的致病因素。除发育外，Brachyury在多种人类癌中的过表达与上皮-间质转化（EMT）、肿瘤转移、癌症干细胞标志物表达以及对化疗和放疗的耐药性相关。机制分析表明，Brachyury参与了涉及成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β的EMT相关信号通路，其转录程序上调间质基因并下调上皮标志物，从而促进侵袭性和球状体形成。利用重组酵母-Brachyury载体疫苗靶向Brachyury阳性肿瘤细胞，可激活Brachyury特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞，这些细胞能够裂解表达Brachyury的人类肿瘤细胞。对人类Brachyury DNA识别复合物的结构研究已开始鉴定与其T-box结构域结合的小分子配体，这表明在脊索瘤和EMT驱动的癌症中，治疗性调节Brachyury活性的途径正在出现。总体而言，Brachyury 是一种结构独特的 T-box 转录因子，其 β-桶/螺旋 DNA 结合域和二聚化界面赋予其选择性识别回文 T-box 位点的能力，其发育作用是通过以 FGF 为中心的基因网络来指定和驱动后部中胚层和脊索的形态发生，其人类多态性影响神经管缺陷的易感性，其在癌中的重新表达和上调在机制上将胚胎中胚层程序与 EMT、干性、转移和免疫治疗靶向联系起来。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:100 1:16000 1:400 - 1:1600
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 47 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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