BRCA1 Antibody [N12F20] Datasheet

生物描述

特异性	BRCA1 Antibody [N12F20] 可检测内源性 BRCA1 总蛋白水平。
背景	BRCA1（乳腺癌 1）是由遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征中发生突变的抑癌基因编码的，其主要功能是作为同源重组 (HR) 修复的支架协调器，通过将 PALB2、BRCA2 和 RAD51 募集到双链断裂处，同时在 S 期和 G2 期抑制易错的非同源末端连接 (NHEJ)，从而通过细胞周期检查点激活和染色质重塑来维持基因组稳定性。 BRCA1（约 1863 个氨基酸）具有 N 端 RING 结构域，其中包含 Cys3HisCys4 基序（Cys24、Cys27、Cys37 催化 E2 泛素连接酶活性），中央 BRCT 结构域包含磷酸丝氨酸结合口袋，其中 Ser988 和 Ser1423 识别位点是保守的，并且具有多个 SQ/TQ 磷酸化位点（例如 ATM/ATR 靶向的 Ser1387 和 Ser1524），这些位点在 DNA 损伤反应期间动态调节蛋白质相互作用。 BRCA1通过泛素化组蛋白H2A来募集修复因子，从而调控同源重组（HR）修复；它磷酸化CtIP以促进末端切除和3'单链DNA尾的形成，从而促进RAD51的加载；它通过Chk1/2激活G2/M期检查点；并通过与p53和BARD1的相互作用转录抑制增殖基因。BRCA1在G1/S期晚期（Aurora A/CDK2靶位点Ser308和Ser1497）发生过度磷酸化，在M期达到峰值，随后在G1期早期发生部分去磷酸化。BRCA1的失活突变（已鉴定超过3000种）会消除HR修复能力，导致双链断裂的积累、基因组不稳定和肿瘤发生，并增加终生罹患乳腺癌和卵巢癌的风险。

特异性

BRCA1 Antibody [N12F20] 可检测内源性 BRCA1 总蛋白水平。

背景

BRCA1（乳腺癌 1）是由遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征中发生突变的抑癌基因编码的，其主要功能是作为同源重组 (HR) 修复的支架协调器，通过将 PALB2、BRCA2 和 RAD51 募集到双链断裂处，同时在 S 期和 G2 期抑制易错的非同源末端连接 (NHEJ)，从而通过细胞周期检查点激活和染色质重塑来维持基因组稳定性。 BRCA1（约 1863 个氨基酸）具有 N 端 RING 结构域，其中包含 Cys3HisCys4 基序（Cys24、Cys27、Cys37 催化 E2 泛素连接酶活性），中央 BRCT 结构域包含磷酸丝氨酸结合口袋，其中 Ser988 和 Ser1423 识别位点是保守的，并且具有多个 SQ/TQ 磷酸化位点（例如 ATM/ATR 靶向的 Ser1387 和 Ser1524），这些位点在 DNA 损伤反应期间动态调节蛋白质相互作用。 BRCA1通过泛素化组蛋白H2A来募集修复因子，从而调控同源重组（HR）修复；它磷酸化CtIP以促进末端切除和3'单链DNA尾的形成，从而促进RAD51的加载；它通过Chk1/2激活G2/M期检查点；并通过与p53和BARD1的相互作用转录抑制增殖基因。BRCA1在G1/S期晚期（Aurora A/CDK2靶位点Ser308和Ser1497）发生过度磷酸化，在M期达到峰值，随后在G1期早期发生部分去磷酸化。BRCA1的失活突变（已鉴定超过3000种）会消除HR修复能力，导致双链断裂的积累、基因组不稳定和肿瘤发生，并增加终生罹患乳腺癌和卵巢癌的风险。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

220 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

BRCA1 Antibody [N12F20]

生物描述

使用信息

文献参考

Application Data