Brg1 Antibody [D24D16] Datasheet

生物描述

特异性	Brg1 Antibody [D24D16] 可检测内源性 Brg1 总蛋白水平。
背景	Brg1是哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合物（包括BAF和PBAF）的核心ATPase亚基，它水解ATP以破坏组蛋白-DNA接触，从而使核小体滑动和重新定位，进而调控约10%至15%参与发育、分化和增殖的基因。Brg1包含与BRM不同的N端富含脯氨酸的区域、用于识别乙酰赖氨酸的溴结构域、解旋酶结构域和SNF2 ATPase结构域（包含七个基序，可产生约10皮牛顿的力，使DNA沿组蛋白八聚体易位），以及具有GYF样折叠的BRK结构域（用于介导蛋白质相互作用）。Brg1可通过LXCXE基序募集至视网膜母细胞瘤蛋白，或通过富含谷氨酰胺的结构域募集至核受体、p53或BRCA1。 Brg1的主要功能是依赖于特定环境的转录激活或抑制：含有BAF250a或BAF250b的Brg1-BAF复合物能够动员p21和p16INK4a启动子处的核小体，并与p53和CBP乙酰转移酶协同作用，在DNA损伤后使p53不稳定，其中PRR对于泛素介导的降解至关重要；而含有BAF200的PBAF-Brg1复合物则通过H2A.Z交换抑制核糖体DNA。Brg1的ATPase活性比基础速率快约100倍，并伴随50个碱基对的DNA易位，从而暴露转录因子结合位点。 Brg1对心脏形态发生至关重要，其敲除会导致胚胎致死和流出道缺陷，这是由于其抑制了Gata4和Nkx2.5的表达；Brg1通过平衡Th17和Treg细胞群来调节T细胞分化；此外，Brg1还通过Oct4和Sox2支持干细胞多能性和胚胎干细胞的自我更新。BRG1突变，包括约20%癌症中发现的截断突变，会模拟SNF5缺失的影响。在胰腺癌、甲状腺髓样癌和伯基特淋巴瘤中，由于RTK通路激活，Brg1失活；但在非小细胞肺癌和鳞状细胞癌中，Brg1可通过与MYC的协同作用发挥反常的癌基因作用。

特异性

Brg1 Antibody [D24D16] 可检测内源性 Brg1 总蛋白水平。

背景

Brg1是哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合物（包括BAF和PBAF）的核心ATPase亚基，它水解ATP以破坏组蛋白-DNA接触，从而使核小体滑动和重新定位，进而调控约10%至15%参与发育、分化和增殖的基因。Brg1包含与BRM不同的N端富含脯氨酸的区域、用于识别乙酰赖氨酸的溴结构域、解旋酶结构域和SNF2 ATPase结构域（包含七个基序，可产生约10皮牛顿的力，使DNA沿组蛋白八聚体易位），以及具有GYF样折叠的BRK结构域（用于介导蛋白质相互作用）。Brg1可通过LXCXE基序募集至视网膜母细胞瘤蛋白，或通过富含谷氨酰胺的结构域募集至核受体、p53或BRCA1。 Brg1的主要功能是依赖于特定环境的转录激活或抑制：含有BAF250a或BAF250b的Brg1-BAF复合物能够动员p21和p16INK4a启动子处的核小体，并与p53和CBP乙酰转移酶协同作用，在DNA损伤后使p53不稳定，其中PRR对于泛素介导的降解至关重要；而含有BAF200的PBAF-Brg1复合物则通过H2A.Z交换抑制核糖体DNA。Brg1的ATPase活性比基础速率快约100倍，并伴随50个碱基对的DNA易位，从而暴露转录因子结合位点。 Brg1对心脏形态发生至关重要，其敲除会导致胚胎致死和流出道缺陷，这是由于其抑制了Gata4和Nkx2.5的表达；Brg1通过平衡Th17和Treg细胞群来调节T细胞分化；此外，Brg1还通过Oct4和Sox2支持干细胞多能性和胚胎干细胞的自我更新。BRG1突变，包括约20%癌症中发现的截断突变，会模拟SNF5缺失的影响。在胰腺癌、甲状腺髓样癌和伯基特淋巴瘤中，由于RTK通路激活，Brg1失活；但在非小细胞肺癌和鳞状细胞癌中，Brg1可通过与MYC的协同作用发挥反常的癌基因作用。

使用信息

抗体应用

WB, IP, ChIP

稀释比例

WB	IP	CHIP
1:1000	1:100	1:150

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

220 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: NCCIT, Lane 2: 3T3, Lane 3: 293T, Lane 4: COS-7