BSCL2/Seipin Antibody (Rabbit mAb) [N16E20] Datasheet

生物描述

特异性	BSCL2/Seipin Antibody (Rabbit mAb) [N16E20] 可检测内源性 BSCL2/Seipin 总蛋白水平。
背景	由BSCL2基因编码的Seipin是一种保守的同源寡聚内质网膜蛋白，它集中于内质网-脂滴连接处，并作为脂滴生物合成和脂肪细胞脂质储存的核心组织者发挥作用。其功能缺失突变会导致最严重的先天性全身性脂肪营养不良，其特征是脂肪组织几乎完全缺失、极度胰岛素抵抗和血脂异常。该蛋白形成具有特定化学计量比的大型环状寡聚体，嵌入内质网双层膜中。对人Seipin的结构和原子力显微镜分析显示，其由12个亚基组成的环状结构，其管腔可以积累中性脂质，表明Seipin提供了一个纳米级支架，可以捕获二酰甘油和甘油三酯，并确定新生脂质晶状体从内质网膜中形成脂滴的位点。在机制层面上，seipin 与中性脂质生物合成酶和 LD 生物发生因子一起聚集在离散的 ER 亚结构域中，并与周围的膜协同作用，控制脂滴形成的位置和效率；seipin 寡聚体作为扩散屏障和脂质变阻器，调节甘油三酯和磷脂的局部可用性，确保中性脂质聚集成大小合适的液滴，而不是形成异常的 ER 聚集或超大的 LD。 Seipin 与微粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GPAT) 同工酶以及脂蛋白 1 和 AGPAT2 存在物理和功能上的相互作用。SEIPIN 缺陷细胞表现出 GPAT 活性升高、GPAT 动力学改变、脂肪生成受阻和脂滴形态异常。然而，在 Seipin 缺陷的前脂肪细胞中抑制或敲低 GPAT 可部分恢复分化，这表明 Seipin 是脂滴生物合成位点上 GPAT 驱动的磷脂酸和三酰甘油合成的进化保守调节因子。在发育中的脂肪细胞中，Seipin 寡聚体将脂蛋白 1 募集到内质网-脂滴连接处，促进脂肪生成转录程序，并调节脂滴扩张和脂肪分解，从而支持有效的脂肪储存，并保护脂肪细胞免受内质网应激和异位脂质沉积的影响。 seipin蛋白的缺失会导致白色脂肪组织形成障碍、严重的肝脂肪变性以及肌肉和肝脏中异位甘油三酯的沉积，这与其作为脂肪分解和脂肪细胞分化的细胞自主调节因子的作用相符。对与Berardinelli-Seip先天性脂肪营养不良相关的自然发生的BSCL2基因突变的分析表明，无义突变和移码突变会消除seipin蛋白的表达或破坏其与lipin 1的结合，而L91P和A212P等点突变则保留了与lipin 1的相互作用，但阻止了正常12聚体环状寡聚体的形成。这表明seipin蛋白组装成特定寡聚体结构以及作为脂肪生成效应分子的支架的能力对其功能都是必需的，并且不同类型的突变通过不同的结构和信号传导缺陷导致疾病。除了脂肪组织外，seipin 还参与神经元和生殖细胞的脂质稳态，而 BSCL2 特定 N 端或跨膜区域的错义突变与常染色体显性进行性神经病和运动神经元疾病有关，这突显了组织特异性的内质网-脂滴偶联和脂质处理紊乱的脆弱性。

特异性

BSCL2/Seipin Antibody (Rabbit mAb) [N16E20] 可检测内源性 BSCL2/Seipin 总蛋白水平。

背景

由BSCL2基因编码的Seipin是一种保守的同源寡聚内质网膜蛋白，它集中于内质网-脂滴连接处，并作为脂滴生物合成和脂肪细胞脂质储存的核心组织者发挥作用。其功能缺失突变会导致最严重的先天性全身性脂肪营养不良，其特征是脂肪组织几乎完全缺失、极度胰岛素抵抗和血脂异常。该蛋白形成具有特定化学计量比的大型环状寡聚体，嵌入内质网双层膜中。对人Seipin的结构和原子力显微镜分析显示，其由12个亚基组成的环状结构，其管腔可以积累中性脂质，表明Seipin提供了一个纳米级支架，可以捕获二酰甘油和甘油三酯，并确定新生脂质晶状体从内质网膜中形成脂滴的位点。在机制层面上，seipin 与中性脂质生物合成酶和 LD 生物发生因子一起聚集在离散的 ER 亚结构域中，并与周围的膜协同作用，控制脂滴形成的位置和效率；seipin 寡聚体作为扩散屏障和脂质变阻器，调节甘油三酯和磷脂的局部可用性，确保中性脂质聚集成大小合适的液滴，而不是形成异常的 ER 聚集或超大的 LD。 Seipin 与微粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶 (GPAT) 同工酶以及脂蛋白 1 和 AGPAT2 存在物理和功能上的相互作用。SEIPIN 缺陷细胞表现出 GPAT 活性升高、GPAT 动力学改变、脂肪生成受阻和脂滴形态异常。然而，在 Seipin 缺陷的前脂肪细胞中抑制或敲低 GPAT 可部分恢复分化，这表明 Seipin 是脂滴生物合成位点上 GPAT 驱动的磷脂酸和三酰甘油合成的进化保守调节因子。在发育中的脂肪细胞中，Seipin 寡聚体将脂蛋白 1 募集到内质网-脂滴连接处，促进脂肪生成转录程序，并调节脂滴扩张和脂肪分解，从而支持有效的脂肪储存，并保护脂肪细胞免受内质网应激和异位脂质沉积的影响。 seipin蛋白的缺失会导致白色脂肪组织形成障碍、严重的肝脂肪变性以及肌肉和肝脏中异位甘油三酯的沉积，这与其作为脂肪分解和脂肪细胞分化的细胞自主调节因子的作用相符。对与Berardinelli-Seip先天性脂肪营养不良相关的自然发生的BSCL2基因突变的分析表明，无义突变和移码突变会消除seipin蛋白的表达或破坏其与lipin 1的结合，而L91P和A212P等点突变则保留了与lipin 1的相互作用，但阻止了正常12聚体环状寡聚体的形成。这表明seipin蛋白组装成特定寡聚体结构以及作为脂肪生成效应分子的支架的能力对其功能都是必需的，并且不同类型的突变通过不同的结构和信号传导缺陷导致疾病。除了脂肪组织外，seipin 还参与神经元和生殖细胞的脂质稳态，而 BSCL2 特定 N 端或跨膜区域的错义突变与常染色体显性进行性神经病和运动神经元疾病有关，这突显了组织特异性的内质网-脂滴偶联和脂质处理紊乱的脆弱性。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

44 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T