C5b-9 + C5b-8 Antibody [P24G22]

目录号：F2102

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生物描述

特异性 C5b-9 + C5b-8 Antibody [P24G22] 可检测内源性 C5b-9 和 C5b-8 总蛋白水平。
背景 C5b-8 和 C5b-9 是补体末端途径的关键中间体和最终效应分子，它们在靶细胞膜上依次组装形成膜攻击复合物 (MAC)，负责先天免疫溶解。C5b-8 由 C5b 与 C6、C7 和异源三聚体 C8（其 α、β 和 γ 亚基分别含有 MACPF/穿孔素、血小板反应蛋白 1 型、EGF 样结构域和 LDL 受体结构域）结合而成。其中，C8α/β 亚基中两亲性的 α-β 发夹结构转变使其能够插入细胞膜，并催化 C9 的募集和聚合，形成一个由 16-18 个单体组成的环状孔（直径约 100-200 Å），该环状孔具有亲水性内通道、β 折叠茎和外 β 发夹壁。 C5b-8 与球状 C9 结合，诱导变构弧形延伸，并通过侧向接触破坏磷脂双层，导致不受控制的 Ca²⁺/Na⁺ 内流、胶体渗透性肿胀和细胞溶解，这对清除病原体至关重要。亚溶解性 MAC 孔道可激活生存通路（例如 Bad 磷酸化和 ERK/NF-κB 信号通路），促进炎症、白细胞募集和促血栓形成作用。宿主细胞受到 CD59 的保护，CD59 与 C8α 的 β 发夹结构结合，形成空间性 β 折叠，从而改变 C9 的运动轨迹并阻止 MAC 组装。 C5b-9 失调会导致阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH)，这是由于 CD55/CD59 丢失和红细胞溶解所致；还会导致非典型溶血性尿毒综合征 (aHUS)，这是由于补体调节因子缺乏所致；此外，C5b-9 失调还会通过旁观者内皮损伤在移植排斥和缺血再灌注损伤中发挥作用。

使用信息

抗体应用 IHC, IF, FCM, ELISA 稀释比例
IHC
1:10 - 1:500
反应性 Human, Baboon, Monkey, Pig, Horse
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

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