Calprotectin (S100A8+A9 complex) Antibody (Mouse mAb) [H13D24] Datasheet

生物描述

特异性	Calprotectin (S100A8+A9 complex) Antibody (Mouse mAb) [H13D24] 可检测内源性 Calprotectin (S100A8+A9 complex) 总蛋白水平。
背景	钙卫蛋白是由S100A8和S100A9组成的异二聚体复合物。S100A8和S100A9是S100家族中的两种钙锌结合蛋白，也是中性粒细胞和单核细胞中最丰富的胞质蛋白之一。该复合物并非通过单一的统一通路发挥作用，而是通过不同的细胞内和细胞外机制发挥作用。在细胞内，钙卫蛋白促进白细胞内花生四烯酸的转运，并直接促进NADPH氧化酶复合物在质膜上的组装。S100A8通过直接结合胞质氧化酶亚基NCF2/p67phox，并将必需的辅因子花生四烯酸转移至正在组装的酶复合物，从而促进该复合物的组装。这使得钙卫蛋白的钙感应功能与中性粒细胞呼吸爆发的激活直接相关。钙卫蛋白一旦从活化的吞噬细胞释放到细胞外，便发挥警报素的作用，与模式识别受体 Toll 样受体 4 (TLR4) 和晚期糖基化终产物受体 (AGEs) 结合；对 TLR4 相互作用的机制分析表明，S100A8 是特异性活性成分，它直接与 TLR4-MD2 受体复合物相互作用，驱动衔接蛋白 MyD88 的胞内转位，并激活白细胞介素-1 受体相关激酶-1 (IL-1RK1)，最终导致 NF-κB 激活和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 表达升高。S100A8-S100A9 复合物的基因缺失可保护小鼠免受内毒素诱导的致死性休克和大肠杆菌诱导的腹腔脓毒症的侵害，这直接证明在全身感染期间，钙卫蛋白的释放会放大而非仅仅伴随内毒素触发的吞噬细胞炎症反应。除了TLR4之外，钙卫蛋白与模式识别受体的结合还能激活平行的MAP激酶信号通路，该通路汇聚并放大相同的NF-κB驱动的促炎级联反应，从而募集更多白细胞，并增加组织损伤或感染部位的细胞因子和趋化因子的释放。此外，钙卫蛋白还可通过螯合微生物生长必需的金属锌发挥抗菌活性，并可通过连接线粒体和溶酶体活性氧生成与BNIP3蛋白的通路诱导靶细胞死亡。这表明，钙卫蛋白的抗菌和诱导细胞凋亡的功能是通过不同于其TLR4-NF-κB促炎信号通路的机制实现的。

特异性

Calprotectin (S100A8+A9 complex) Antibody (Mouse mAb) [H13D24] 可检测内源性 Calprotectin (S100A8+A9 complex) 总蛋白水平。

背景

钙卫蛋白是由S100A8和S100A9组成的异二聚体复合物。S100A8和S100A9是S100家族中的两种钙锌结合蛋白，也是中性粒细胞和单核细胞中最丰富的胞质蛋白之一。该复合物并非通过单一的统一通路发挥作用，而是通过不同的细胞内和细胞外机制发挥作用。在细胞内，钙卫蛋白促进白细胞内花生四烯酸的转运，并直接促进NADPH氧化酶复合物在质膜上的组装。S100A8通过直接结合胞质氧化酶亚基NCF2/p67phox，并将必需的辅因子花生四烯酸转移至正在组装的酶复合物，从而促进该复合物的组装。这使得钙卫蛋白的钙感应功能与中性粒细胞呼吸爆发的激活直接相关。钙卫蛋白一旦从活化的吞噬细胞释放到细胞外，便发挥警报素的作用，与模式识别受体 Toll 样受体 4 (TLR4) 和晚期糖基化终产物受体 (AGEs) 结合；对 TLR4 相互作用的机制分析表明，S100A8 是特异性活性成分，它直接与 TLR4-MD2 受体复合物相互作用，驱动衔接蛋白 MyD88 的胞内转位，并激活白细胞介素-1 受体相关激酶-1 (IL-1RK1)，最终导致 NF-κB 激活和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 表达升高。S100A8-S100A9 复合物的基因缺失可保护小鼠免受内毒素诱导的致死性休克和大肠杆菌诱导的腹腔脓毒症的侵害，这直接证明在全身感染期间，钙卫蛋白的释放会放大而非仅仅伴随内毒素触发的吞噬细胞炎症反应。除了TLR4之外，钙卫蛋白与模式识别受体的结合还能激活平行的MAP激酶信号通路，该通路汇聚并放大相同的NF-κB驱动的促炎级联反应，从而募集更多白细胞，并增加组织损伤或感染部位的细胞因子和趋化因子的释放。此外，钙卫蛋白还可通过螯合微生物生长必需的金属锌发挥抗菌活性，并可通过连接线粒体和溶酶体活性氧生成与BNIP3蛋白的通路诱导靶细胞死亡。这表明，钙卫蛋白的抗菌和诱导细胞凋亡的功能是通过不同于其TLR4-NF-κB促炎信号通路的机制实现的。

使用信息

抗体应用

WB, FCM

稀释比例

WB	IHC	FCM
1:1000	1:100	1:10

反应性

Human

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

13 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

IHC

Validated by Selleck

Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human tonsils tissue with F2919 at 1:100 dilution.