Calsequestrin 1 Antibody [P19M13] Datasheet

生物描述

特异性	Calsequestrin 1 Antibody [P19M13] 可检测内源性 Calsequestrin 1 总蛋白水平。
背景	钙结合蛋白1 (CASQ1) 是快肌肌浆网末端池中主要的钙结合高容量、低亲和力蛋白，对于肌肉收缩过程中快速释放钙离子并防止钙过载至关重要。CASQ1由三个硫氧还蛋白样结构域（I-III）组成，这些结构域由五链β折叠片层构成，两侧由α螺旋连接。CASQ1具有富含天冬氨酸和谷氨酸残基的柔性N端和C端尾部，这些尾部形成多个钙结合口袋。在管腔内Ca²⁺浓度约为1 mM时，CASQ1单体通过C端背靠背二聚化（由富含Asp的CAS基序介导，每个基序可结合6-8个Ca²⁺离子）和N端前向相互作用（由Glu55-Lys49盐桥稳定）聚合，形成带负电荷的聚合物网络，每个分子可缓冲多达80个Ca²⁺离子。这些聚合物进一步压缩以容纳更高的Ca²⁺负载，并通过三联蛋白和连接蛋白锚定到兰尼碱受体（RyR1）上，从而促进有效Ca²⁺释放所需的紧密接近。 CASQ1 聚合作用使得肌浆网 (SR) 能够大量储存 Ca²⁺，同时保持较低的游离 Ca²⁺ 浓度，从而抵御渗透压应激，并作为管腔内 Ca²⁺ 的动态传感器：在高 Ca²⁺ 浓度下，聚合物的邻近作用会抑制 RyR1 的活性以维持 Ca²⁺ 储存；而当 Ca²⁺ 释放时，聚合物的解聚作用会解除抑制，从而增强兴奋-收缩耦联。CASQ1 还通过与 STIM1/2 的反向信号传导来调节储存操纵性 Ca²⁺ 内流 (SOCE)，协调 SERCA 的重吸收，并防止肌肉疲劳期间 Ca²⁺ 耗竭。CASQ1 的突变会损害其聚合或锚定，从而破坏 SR 对 Ca²⁺ 的处理，导致病理性 Ca²⁺ 泄漏、肌肉无力以及恶性高热、环境性中暑和管状聚集性肌病等疾病，这些疾病的特征是致命的高代谢危象。

特异性

Calsequestrin 1 Antibody [P19M13] 可检测内源性 Calsequestrin 1 总蛋白水平。

背景

钙结合蛋白1 (CASQ1) 是快肌肌浆网末端池中主要的钙结合高容量、低亲和力蛋白，对于肌肉收缩过程中快速释放钙离子并防止钙过载至关重要。CASQ1由三个硫氧还蛋白样结构域（I-III）组成，这些结构域由五链β折叠片层构成，两侧由α螺旋连接。CASQ1具有富含天冬氨酸和谷氨酸残基的柔性N端和C端尾部，这些尾部形成多个钙结合口袋。在管腔内Ca²⁺浓度约为1 mM时，CASQ1单体通过C端背靠背二聚化（由富含Asp的CAS基序介导，每个基序可结合6-8个Ca²⁺离子）和N端前向相互作用（由Glu55-Lys49盐桥稳定）聚合，形成带负电荷的聚合物网络，每个分子可缓冲多达80个Ca²⁺离子。这些聚合物进一步压缩以容纳更高的Ca²⁺负载，并通过三联蛋白和连接蛋白锚定到兰尼碱受体（RyR1）上，从而促进有效Ca²⁺释放所需的紧密接近。 CASQ1 聚合作用使得肌浆网 (SR) 能够大量储存 Ca²⁺，同时保持较低的游离 Ca²⁺ 浓度，从而抵御渗透压应激，并作为管腔内 Ca²⁺ 的动态传感器：在高 Ca²⁺ 浓度下，聚合物的邻近作用会抑制 RyR1 的活性以维持 Ca²⁺ 储存；而当 Ca²⁺ 释放时，聚合物的解聚作用会解除抑制，从而增强兴奋-收缩耦联。CASQ1 还通过与 STIM1/2 的反向信号传导来调节储存操纵性 Ca²⁺ 内流 (SOCE)，协调 SERCA 的重吸收，并防止肌肉疲劳期间 Ca²⁺ 耗竭。CASQ1 的突变会损害其聚合或锚定，从而破坏 SR 对 Ca²⁺ 的处理，导致病理性 Ca²⁺ 泄漏、肌肉无力以及恶性高热、环境性中暑和管状聚集性肌病等疾病，这些疾病的特征是致命的高代谢危象。

使用信息

抗体应用

WB, IHC

稀释比例

WB	IHC
1:10000 - 1:50000	1:100 - 1:250

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

44 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
IHC	实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Mouse muscle, Lane 2: Rat muscle