Cas9 (S. pyogenes) Antibody [L14C20]

目录号：F0428

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生物描述

特异性 Cas9 (S. pyogenes) Antibody [L14C20] 可检测内源性 Cas9 (S. pyogenes) 总蛋白水平。
背景 来自化脓性链球菌的 Cas9 (SpCas9) 是一种由 1,368 个氨基酸组成的 RNA 引导的核酸内切酶，是 II 型 CRISPR 适应性免疫的核心。它与引导 RNA (gRNA: crRNA-tracrRNA 杂交体) 形成核糖核蛋白复合物，该复合物能够识别并切割 NGG 前间隔序列邻近基序 (PAM) 位点的入侵病毒 DNA。这一特性使得 SpCas9 成为精确基因组编辑应用的基础。 SpCas9 采用双叶结构：N 端识别 (REC) 叶由 REC1 和 REC2 结构域组成，用于包裹 gRNA 进行靶标扫描；C 端核酸酶 (NUC) 叶包含 RuvC（氨基酸残基 1–59、718–769、1096–1184）和 HNH（氨基酸残基 775–908）核酸内切酶结构域，两者之间由螺旋状的 PAM 序列识别桥螺旋 (Arg1333/Glu1219) 连接。此外，L1 和 L2 结构叶稳定了 DNA 在种子序列配对后穿过的中央通道。 gRNA-Cas9 复合物首先通过浅小沟接触（Arg1335/Gln1119）扫描 DNA 中的 PAM 序列，然后从 PAM 近端“种子”区域（位置 1-12）开始碱基配对，置换非靶 DNA 链，形成由氢键网络（特别是 Ser808/Arg661 与磷酸骨架）稳定的 R 环杂交体。这会触发构象转换，打开HNH和RuvC催化中心，每个催化中心均由两个Mg²⁺离子配位：HNH（Arg661/Asp839）切割靶链，RuvC（Asp10/His983/Asp986）切割非靶链，通过顺序切割（RuvC在HNH之前切割，延迟约0.2秒）在PAM上游3 bp处产生平末端双链断裂（DSB）。种子错配去稳定化和PAM远端校正确保了编辑的准确性。SpCas9的可编程性不仅使其能够进行基因组编辑，还能进行碱基编辑（例如，dCas9-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白）和转录调控（例如，dCas9-VP64用于激活/抑制），其治疗应用包括通过BCL11A编辑来纠正镰状细胞贫血症。

使用信息

抗体应用 WB, IF, FCM 稀释比例
WB IF FCM
1:1000 1:100 - 1:400 1:50 - 1:200
反应性 All Species Expected
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 160 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (transfected with Cas9)