Cathepsin L Antibody (Mouse mAb) [E18C8]

目录号：F6522

打印

生物描述

特异性 Cathepsin L Antibody (Mouse mAb) [E18C8] 可检测内源性 Cathepsin L 总蛋白水平。
背景 组织蛋白酶L是木瓜蛋白酶家族中的一种溶酶体半胱氨酸内肽酶，是内/溶酶体蛋白水解系统的重要组成部分。它参与细胞内蛋白质的组成性周转、内吞货物的降解以及特定前体蛋白和细胞外基质成分的加工。该酶以无活性的前体蛋白形式合成，去除信号肽和前肽后，在酸性区室中成熟，最终生成活性蛋白酶。活性蛋白酶主要定位于溶酶体，但在特定条件下也可分泌到细胞周围空间发挥作用。催化结构域包含保守的Cys-His-Asn催化三联体和C1肽酶特有的底物结合裂隙，并在疏水性和碱性残基之后切割肽键，从而对细胞内蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白以及α1-蛋白酶抑制剂等调节蛋白具有广泛的特异性。α1-蛋白酶抑制剂将组织蛋白酶L的活性与其他蛋白酶系统的调节联系起来。在免疫系统中，组织蛋白酶L通过降解不变链和塑造加载到MHC II类分子上的肽库参与抗原加工，并通过特异性切割激活某些前体酶（例如前肝素酶），生成具有催化活性的形式，从而能够重塑富含硫酸乙酰肝素的细胞外基质。转化细胞中组织蛋白酶L的表达上调和转运改变与前体酶分泌增加、细胞外基质蛋白降解增强以及侵袭性和转移扩散的促进相关。该酶对生长调节蛋白和基质成分的活性使其成为恶性表型形成的重要因素。除癌症外，组织蛋白酶L在心血管、肾脏和肌肉骨骼疾病中也发挥作用。其切割结构蛋白和信号调节因子的能力与肌原纤维损伤、心肌缺血性损伤以及肾小管对蛋白尿的反应相关，其表达失调常见于组织重塑和炎症病变中。该蛋白酶还参与病毒致病过程，作为某些病毒糖蛋白的关键内溶酶体激活剂，包括肝素酶依赖性促进病毒传播和组织蛋白酶 L 介导的加工步骤，这些步骤可以促进冠状病毒和丝状病毒通过内吞途径进入，这将其溶酶体功能与宿主-病原体相互作用联系起来。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:500-1:1000 1:80 1:80-1:200 1:100
反应性 Human, Mouse
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 38 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Recombinant Human Cathepsin L Protein