Caveolin 3 Antibody (Mouse mAb) [L5G2]

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生物描述

特异性 Caveolin 3 Antibody (Mouse mAb) [L5G2] 可检测内源性 Caveolin 3 总蛋白水平。
背景 Caveolin-3 与 Caveolin-1 和 Caveolin-2 同属 Caveolin 家族，是一类膜支架蛋白。但与同源蛋白不同的是，Caveolin-3 的表达仅限于横纹肌，在心肌和骨骼肌组织中也有分布。在横纹肌中，Caveolin-3 是构成 Caveolae（烧瓶状质膜内陷）的关键结构成分。该蛋白的 N 端和 C 端均暴露于细胞质中，其中央疏水区段形成一个嵌入膜内的环状结构，该环状结构并不完全穿过双层膜。位于细胞质区域的 Caveolin 支架结构域介导直接的蛋白质-蛋白质相互作用，从而将信号通路相关蛋白募集到 Caveolae 膜微区。通过其支架结构域，caveolin-3 直接与骨骼肌 L 型钙通道的孔道形成 α 亚基 Cav1.1 的胞内 I-II 环结合。这两种蛋白可从三联体膜制备物中共同免疫沉淀，并在 T 管膜内共定位。这种直接物理相互作用的丧失会导致培养的肌管和胎儿骨骼肌纤维中 L 型钙通道的最大电导降低一半。此外，caveolin-3 还通过相同的支架机制与一氧化氮合酶同工酶和 G 蛋白偶联受体信号通路组分相互作用，将 caveolae 定位为组织平台，将兴奋偶联和 β-肾上腺素能信号通路集中于特定的膜位点，而不是允许这些组分自由扩散穿过肌膜。 Caveolin-3 也与肌营养不良蛋白共纯化，并且是肌营养不良蛋白相关蛋白池的一部分，其胞质 WW 样结构域与 β-肌营养不良蛋白聚糖上的相同 PPXY 序列结合，该序列也被肌营养不良蛋白的 WW 结构域识别，这意味着 Caveolin-3 和肌营养不良蛋白竞争肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物上的重叠结合位点，因此 Caveolin-3 的过表达可以将肌营养不良蛋白从质膜上置换下来，并促进其降解。根据突变位置的不同，点突变会以不同的方式破坏这些相互作用：跨膜结构域内的 P104L 替换和支架结构域内的九个碱基对微缺失均会导致肌膜 caveolin-3 蛋白显著减少，并引起常染色体显性肢带型肌营养不良症 1C 型；而其他 CAV3 突变则集中在柔性 N 端和支架结构域，并与肌波纹病、远端肌病和高肌酸激酶血症相关。由于 caveolin-3 的缺失会直接破坏钙通道的电导，并破坏其与肌营养不良蛋白在膜上的竞争平衡，因此该蛋白作为一个特定的结构和信号枢纽发挥作用，其功能紊乱在机制上与 CAV3 突变相关的肌营养不良症和心律失常表型密切相关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 17 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse muscle