CBS Antibody [J23E1] Datasheet

生物描述

特异性	CBS Antibody [J23E1] 可检测内源性 CBS 总蛋白水平。
背景	胱硫醚β-合成酶 (CBS) 是转硫途径中限速的吡哆醛5'-磷酸 (PLP) 依赖性酶。它催化丝氨酸羟基被同型半胱氨酸β-取代，生成胱硫醚，从而将硫从蛋氨酸转移到半胱氨酸的生物合成途径，并通过其他半胱氨酸依赖性反应生成硫化氢 (H₂S)。人 CBS 形成同源四聚体，其 N 端包含一个血红素结合域，该域结合铁卟啉以感知氧化还原和 CO 的变化；一个中央 PLP 催化域，其中包含活性位点，赖氨酸 47 在此形成席夫碱中间体，并通过静电相互作用稳定碳负离子或氨基丙烯酸酯类；以及 C 端串联的 CBS 结构域，该结构域结合 S-腺苷甲硫氨酸 (AdoMet)，通过增强四聚体的刚性和提高 PLP 位点的可及性来实现变构激活。 CBS维持同型半胱氨酸稳态，这对血管健康至关重要。在蛋氨酸浓度较高的情况下，AdoMet诱导的激活可增强同型半胱氨酸的代谢通量。血红素通过改变PLP互变异构体来调节酶活性，从而在氧化应激下抑制酶的活性。同时，H₂S的产生作为一种气体信号分子，通过硫氢化作用调节血管舒张、神经调节和细胞保护，其作用靶点包括K(ATP)通道和蛋白激酶。该酶的四聚体组装使调节性CBS结构域远离催化核心，从而传递构象变化，重新定位活性位点残基（如赖氨酸和精氨酸），以在β-取代过程中稳定两性离子中间体。CBS缺乏会导致同型半胱氨酸尿症，进而引发高同型半胱氨酸血症、血栓栓塞、晶状体脱位、骨骼异常以及认知障碍，这些都归因于毒性同型半胱氨酸的积累以及H₂S和谷胱甘肽合成受损。致病突变通常会破坏四聚体化、血红素或PLP结合或AdoMet反应性。

特异性

CBS Antibody [J23E1] 可检测内源性 CBS 总蛋白水平。

背景

胱硫醚β-合成酶 (CBS) 是转硫途径中限速的吡哆醛5'-磷酸 (PLP) 依赖性酶。它催化丝氨酸羟基被同型半胱氨酸β-取代，生成胱硫醚，从而将硫从蛋氨酸转移到半胱氨酸的生物合成途径，并通过其他半胱氨酸依赖性反应生成硫化氢 (H₂S)。人 CBS 形成同源四聚体，其 N 端包含一个血红素结合域，该域结合铁卟啉以感知氧化还原和 CO 的变化；一个中央 PLP 催化域，其中包含活性位点，赖氨酸 47 在此形成席夫碱中间体，并通过静电相互作用稳定碳负离子或氨基丙烯酸酯类；以及 C 端串联的 CBS 结构域，该结构域结合 S-腺苷甲硫氨酸 (AdoMet)，通过增强四聚体的刚性和提高 PLP 位点的可及性来实现变构激活。 CBS维持同型半胱氨酸稳态，这对血管健康至关重要。在蛋氨酸浓度较高的情况下，AdoMet诱导的激活可增强同型半胱氨酸的代谢通量。血红素通过改变PLP互变异构体来调节酶活性，从而在氧化应激下抑制酶的活性。同时，H₂S的产生作为一种气体信号分子，通过硫氢化作用调节血管舒张、神经调节和细胞保护，其作用靶点包括K(ATP)通道和蛋白激酶。该酶的四聚体组装使调节性CBS结构域远离催化核心，从而传递构象变化，重新定位活性位点残基（如赖氨酸和精氨酸），以在β-取代过程中稳定两性离子中间体。CBS缺乏会导致同型半胱氨酸尿症，进而引发高同型半胱氨酸血症、血栓栓塞、晶状体脱位、骨骼异常以及认知障碍，这些都归因于毒性同型半胱氨酸的积累以及H₂S和谷胱甘肽合成受损。致病突变通常会破坏四聚体化、血红素或PLP结合或AdoMet反应性。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

61 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

CBS Antibody [J23E1]

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使用信息

文献参考

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