CCL20/MIP-3α Antibody (Rabbit mAb) [G18F18]

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生物描述

特异性 CCL20/MIP-3α Antibody (Rabbit mAb) [G18F18] 可检测内源性 CCL20/MIP-3α 总蛋白水平。
背景 CCL20，又称巨噬细胞炎症蛋白3α，属于CC趋化因子亚家族，与A类G蛋白偶联受体CCR6形成排他性的单配体-受体配对，仅与人β-防御素在同一结合位点存在低亲和力竞争。CCR6位于一个由三个胞外环和三个胞内环连接的七次跨膜螺旋束内。CCL20与该受体结合于一个浅的胞外口袋，而非其他A类GPCR典型的深激动剂结合位点。受体的N端残基包裹在趋化因子的球状核心上，从而完成对接界面。配体结合主要激活Gαi信号通路，抑制腺苷酸环化酶并抑制环磷酸腺苷（cAMP）的生成；同时，释放的Gβγ亚基激活磷脂酶C以提高细胞内钙离子浓度，并激活磷脂酰肌醇-3-激酶，进而促进ERK1/2磷酸化和肌动蛋白聚合，最终驱动细胞定向迁移。除了经典的G蛋白信号通路外，GPCR激酶对CCR6的磷酸化还能募集β-arrestin，后者形成一个信号支架，该支架能够独立于G蛋白偶联激活c-Src、ERK1/2、p38、JNK和Akt，同时介导受体脱敏和内吞作用。在CD4阳性T细胞中，这种受体近端信号传导延伸至代谢重编程，因为CCR6的激活驱动雷帕霉素敏感的PI3K、Akt、mTORC1和STAT3的磷酸化，这一级联反应使T细胞代谢从氧化磷酸化转向糖酵解，引导其分化为以T-bet和RORγt共表达为特征的炎症性Th1样Th17表型。CCL20由上皮细胞组成性产生，并在炎症期间急剧升高，形成梯度，募集表达CCR6的Th17细胞、调节性T细胞、未成熟树突状细胞、B细胞和固有淋巴细胞进入受损组织。CCR6/CCL20轴一方面通过平衡Th17和Treg细胞的迁移来维持免疫稳态，另一方面，当这种平衡被打破时，则会导致组织损伤性炎症。 CCL20/CCR6信号通路的双重作用使其成为黏膜免疫监视和病理细胞募集的决定因素，因为溃疡性结肠炎中已证实存在表达CCR6的致病性Th17细胞群增加和上皮细胞CCL20水平升高，并且这些指标与多种炎症性和自身免疫性疾病的严重程度相关。通过抗体或小分子拮抗剂破坏CCR6-CCL20相互作用可阻断表达CCR6的免疫细胞向炎症组织的迁移，并降低实验模型中的疾病严重程度。此外，CD4 T细胞中CCR6的缺失可特异性地阻止结肠炎期间致病性RORγt阳性T-bet阳性Th17细胞的分化，这凸显了该受体作为特定信号节点的功能，该节点调控促炎淋巴细胞的迁移和效应程序化。

使用信息

抗体应用 IHC, IF, FCM 稀释比例
IHC IF FCM
1:2000 1:100 1:600
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 11 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human colon tissue with F8584 at 1:2000 dilution.