CD3 ζ Antibody (Armenian hamster mAb) [N1P1]

目录号：F5579

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生物描述

特异性

CD3 ζ Antibody (Armenian hamster mAb) [N1P1] 可检测内源性 CD3 ζ 总蛋白水平。
背景

由 CD247 基因编码的 CD3ζ 是 T 细胞受体-CD3 复合物的主要信号转导亚基；在 T 淋巴细胞表面，它以二硫键连接的同源二聚体形式，与抗原结合性的 TCRαβ 异源二聚体以及 CD3γε 和 CD3δε 二聚体配对组装。该链通过一段短的胞外片段和一个带有带负电荷残基的跨膜结构域锚定在受体复合物中。其长胞质尾部包含三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM），这与 CD3γ、CD3δ 和 CD3ε 仅含单个 ITAM 的胞质结构域形成鲜明对比，使得 ζζ 同源二聚体在一个信号传导模块内拥有六个酪氨酸磷酸化位点。当 TCR 结合抗原时，Src 家族激酶 Lck 和 Fyn 会触发这些 ITAM 酪氨酸残基的磷酸化。由此产生的磷酸化酪氨酸对形成对接位点，通过串联 SH2 结构域招募 ZAP-70，从而将 ZAP-70 转化为具有催化活性的激酶。活化的 ZAP-70 进一步传递信号，引发下游的钙离子动员、Ras-MAPK 激活以及调控 T 细胞活化和细胞因子产生的转录程序。CD3 各亚基总共贡献了十个 ITAM（每条 ζ 链贡献三个，其余 CD3 链各贡献一个），这些 ITAM 在受体触发过程中协同发挥作用。CD3ζ 参与 T 细胞分化过程中的胸腺选择以及外周 T 细胞应答。CD3ζ 的表达及磷酸化状态与其周围受体复合物的组成密切相关。在系统性红斑狼疮患者的 T 淋巴细胞中，TCR/CD3 复合物内的 CD3ζ 被结构相关的 FcRγ 链所取代。这种置换改变了受体近端酪氨酸磷酸化的模式，并将下游激酶的招募方向从 ZAP-70 转向了 Syk。与依赖完整 CD3ζ 的 ZAP-70 信号传导途径相比，这种 Syk 相关的信号传导会导致钙离子应答及白细胞介素-2（IL-2）产生发生改变。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB
1:500
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Armenian hamster Monoclonal Antibody MW 19 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Murine Splenocytes