CDC42 Antibody (Rabbit mAb) [B14M24] Datasheet

生物描述

特异性	CDC42 Antibody (Rabbit mAb) [B14M24] 可检测内源性 CDC42 总蛋白水平。
背景	CDC42 是一种小型 Rho 家族 GTP 酶，它作为一种保守的分子开关，调控肌动蛋白细胞骨架的组织、细胞极性、膜运输以及信号通路，从而调节多种哺乳动物组织的生长和分化。该蛋白包含一个典型的小 GTP 酶折叠，其 P 环 NTP 结合域、在 GTP 结合和水解后发生构象变化的开关 I 和开关 II 区，以及一个经异戊二烯化修饰的 C 端 CAAX 基序，该基序可将 CDC42 锚定在特定的膜区室，受体和支架蛋白可募集其特异性的鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 和 GTP 酶激活蛋白 (GAP)。在 GEF（催化 GDP-GTP 交换）、GAP（加速内源性 GTP 水解）和 RhoGDI（结合 GDP 结合的 CDC42 并将其保留在胞质中，直至接收到适当的信号将其释放以进行膜靶向和激活）的协同作用下，CDC42 在 GDP 结合的非活性状态和 GTP 结合的活性状态之间循环。活性CDC42与多种效应蛋白相互作用，包括p21激活激酶、N-WASP/WASP和PAR极性复合物。这些效应蛋白将CDC42的激活与Arp2/3依赖的肌动蛋白成核、富含肌动蛋白的丝状伪足的形成、顶端-基底极性的建立以及黏附连接和紧密连接的组织联系起来，从而协调上皮形态发生、定向迁移以及管腔和屏障的形成。CDC42还与IQGAP蛋白、MRCK激酶以及高尔基体和质膜上的调节因子相互作用，将肌动球蛋白的收缩性与囊泡运输和微管动力学整合起来，从而塑造连接稳定性、极性分泌和细胞器定位。在内分泌组织中，葡萄糖刺激的CDC42激活作为胰岛素刺激-分泌偶联的早期信号发挥作用，CDC42调节皮质肌动蛋白重塑和胞吐机制的募集，而胞吐机制是胰岛素持续释放的第二时相所必需的。在控制细胞增殖和存活的信号网络中，CDC42调节EGFR-mTORC1等通路，并促进下游级联反应（包括MAPK和PI3K）的激活，进而影响转录程序和细胞周期进程。种系突变和CDC42活性失调与发育性疾病和自身炎症性疾病相关，而肿瘤中CDC42的过表达或过度激活则与肿瘤细胞的运动性增强、侵袭性和转移扩散相关。

特异性

CDC42 Antibody (Rabbit mAb) [B14M24] 可检测内源性 CDC42 总蛋白水平。

背景

CDC42 是一种小型 Rho 家族 GTP 酶，它作为一种保守的分子开关，调控肌动蛋白细胞骨架的组织、细胞极性、膜运输以及信号通路，从而调节多种哺乳动物组织的生长和分化。该蛋白包含一个典型的小 GTP 酶折叠，其 P 环 NTP 结合域、在 GTP 结合和水解后发生构象变化的开关 I 和开关 II 区，以及一个经异戊二烯化修饰的 C 端 CAAX 基序，该基序可将 CDC42 锚定在特定的膜区室，受体和支架蛋白可募集其特异性的鸟嘌呤核苷酸交换因子 (GEF) 和 GTP 酶激活蛋白 (GAP)。在 GEF（催化 GDP-GTP 交换）、GAP（加速内源性 GTP 水解）和 RhoGDI（结合 GDP 结合的 CDC42 并将其保留在胞质中，直至接收到适当的信号将其释放以进行膜靶向和激活）的协同作用下，CDC42 在 GDP 结合的非活性状态和 GTP 结合的活性状态之间循环。活性CDC42与多种效应蛋白相互作用，包括p21激活激酶、N-WASP/WASP和PAR极性复合物。这些效应蛋白将CDC42的激活与Arp2/3依赖的肌动蛋白成核、富含肌动蛋白的丝状伪足的形成、顶端-基底极性的建立以及黏附连接和紧密连接的组织联系起来，从而协调上皮形态发生、定向迁移以及管腔和屏障的形成。CDC42还与IQGAP蛋白、MRCK激酶以及高尔基体和质膜上的调节因子相互作用，将肌动球蛋白的收缩性与囊泡运输和微管动力学整合起来，从而塑造连接稳定性、极性分泌和细胞器定位。在内分泌组织中，葡萄糖刺激的CDC42激活作为胰岛素刺激-分泌偶联的早期信号发挥作用，CDC42调节皮质肌动蛋白重塑和胞吐机制的募集，而胞吐机制是胰岛素持续释放的第二时相所必需的。在控制细胞增殖和存活的信号网络中，CDC42调节EGFR-mTORC1等通路，并促进下游级联反应（包括MAPK和PI3K）的激活，进而影响转录程序和细胞周期进程。种系突变和CDC42活性失调与发育性疾病和自身炎症性疾病相关，而肿瘤中CDC42的过表达或过度激活则与肿瘤细胞的运动性增强、侵袭性和转移扩散相关。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Bovine

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

21 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Jurkat, Lane 2: C6, Lane 3: NIH/3T3