CDK12 Antibody (Rabbit mAb) [N24C20]

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生物描述

特异性

CDK12 Antibody (Rabbit mAb) [N24C20] 可检测内源性 CDK12 总蛋白水平。
背景

CDK12 是一种转录相关的细胞周期蛋白依赖性激酶，它与细胞周期蛋白 K 形成活性复合物，并作为 RNA 聚合酶 II 的羧基末端结构域 (CTD) 激酶发挥作用，从而成为转录延伸和 RNA 加工的全局调控因子，尤其对参与 DNA 损伤反应和基因组维持的长基因具有重要影响。该激酶包含一个典型的 CDK 催化核心，该核心具有激活环和一个大的 C 端延伸，后者有助于 CTD 结合和底物选择性。CDK12-细胞周期蛋白 K 复合物可磷酸化 RNAPII CTD 七肽重复序列中的 Ser2 和 Ser5 残基，从而增强基因体上的持续延伸和高效转录。CDK12 活性可刺激多种蛋白质编码基因上的 RNAPII 延伸，并且还影响转录终止、共转录剪接和 RNA 周转，部分是通过直接磷酸化与延伸中的聚合酶结合的 RNA 加工因子来实现的。 CDK12 对编码关键 DNA 损伤反应和同源重组蛋白（如 BRCA1、ATR、FANCI 和其他 HR 因子）的长而复杂的基因具有很强的功能偏好性；抑制或缺失 CDK12 会导致基因长度依赖性的延伸缺陷、内含子内的过早切割和多聚腺苷酸化，以及这些 DNA 损伤反应 (DDR) 转录本的显著下调，从而导致 DNA 修复能力下降和基因组不稳定。这种选择性源于 CTD 磷酸化缺陷和内含子多聚腺苷酸化位点前体 mRNA 加工调控的改变，使得长 DDR 基因对 CDK12 依赖性延伸和加工的减少尤为敏感。CDK12 还通过控制 RNAPII 在这些位点的加工能力来调控核心 DNA 复制基因和其他细胞周期调控因子的表达，从而有助于 G1/S 期的正常进行以及复制和修复之间的协调。在癌症中，复发性 CDK12 功能丧失突变发生在高级别浆液性卵巢癌、前列腺癌和其他肿瘤类型中，并与串联重复、局部基因组重排和独特的基因组不稳定性特征相关，这反映了同源重组基因的转录缺陷，而不是复制或修复酶中的直接催化损伤。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:10000 1:30 1:500
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 164 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela, Lane 2: 293T, Lane 3: K-562, Lane 4: NIH/3T3