Cdk8 Antibody (Rabbit mAb) [G17E8] Datasheet

生物描述

特异性	Cdk8 Antibody (Rabbit mAb) [G17E8] 可检测内源性 Cdk8 总蛋白水平。
背景	CDK8 是一种细胞周期蛋白依赖性激酶，在特定的介导复合物中作为 CDK8 激酶模块的催化核心发挥作用，并作为一种转录调控激酶，将信号输入整合到 RNA 聚合酶 II 依赖的基因表达程序中。该激酶与细胞周期蛋白 C、MED12 和 MED13 结合形成 CDK8 亚复合物，该亚复合物以可逆的方式与介导复合物核心结合。这种构型使 CDK8 活性位点能够磷酸化基础转录机制的组成部分、转录因子和延伸调节因子，而无需介导复合物本身的组装。CDK8 磷酸化转录因子和共激活因子，包括血清反应和早期生长反应网络成员，并且还靶向 RNA 聚合酶 II 的羧基末端结构域和延伸相关因子，这些因子调节从起始到有效延伸的转变以及含有正转录延伸因子 b 的延伸复合物的组装和活性。在血清反应网络中，CDK8 通过促进 P-TEFb 和 BRD4 募集至启动子和增强子，并防止低磷酸化、延伸缓慢的 RNA 聚合酶 II 复合物的积累，从而作为转录延伸的正调控因子，最终在有丝分裂原刺激后有效诱导 AP-1 和 EGR 家族转录因子等早期基因的表达。CDK8 激酶模块还发挥着依赖于环境的抑制功能；含有 CDK8 亚复合物的介导复合物可以阻断某些启动子处的起始前复合物形成，并调节介导复合物与 RNA 聚合酶 II 之间的相互作用，从而控制基础机制对特定转录因子结合的调控区域的访问。 CDK8活性参与多种信号通路，包括Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad、STAT和核激素受体通路。它通过磷酸化通路特异性转录因子和共调节因子，并调节其转录输出的幅度和持续时间，将细胞外信号和致癌信号与介导因子依赖性基因表达联系起来。CDK8激酶模块调控一系列参与代谢、细胞周期进程和细胞存活的基因，并通过转录调控凋亡和自噬基因以及细胞周期蛋白C在线粒体动力学中的非转录作用，在细胞生死抉择中发挥关键作用。

特异性

Cdk8 Antibody (Rabbit mAb) [G17E8] 可检测内源性 Cdk8 总蛋白水平。

背景

CDK8 是一种细胞周期蛋白依赖性激酶，在特定的介导复合物中作为 CDK8 激酶模块的催化核心发挥作用，并作为一种转录调控激酶，将信号输入整合到 RNA 聚合酶 II 依赖的基因表达程序中。该激酶与细胞周期蛋白 C、MED12 和 MED13 结合形成 CDK8 亚复合物，该亚复合物以可逆的方式与介导复合物核心结合。这种构型使 CDK8 活性位点能够磷酸化基础转录机制的组成部分、转录因子和延伸调节因子，而无需介导复合物本身的组装。CDK8 磷酸化转录因子和共激活因子，包括血清反应和早期生长反应网络成员，并且还靶向 RNA 聚合酶 II 的羧基末端结构域和延伸相关因子，这些因子调节从起始到有效延伸的转变以及含有正转录延伸因子 b 的延伸复合物的组装和活性。在血清反应网络中，CDK8 通过促进 P-TEFb 和 BRD4 募集至启动子和增强子，并防止低磷酸化、延伸缓慢的 RNA 聚合酶 II 复合物的积累，从而作为转录延伸的正调控因子，最终在有丝分裂原刺激后有效诱导 AP-1 和 EGR 家族转录因子等早期基因的表达。CDK8 激酶模块还发挥着依赖于环境的抑制功能；含有 CDK8 亚复合物的介导复合物可以阻断某些启动子处的起始前复合物形成，并调节介导复合物与 RNA 聚合酶 II 之间的相互作用，从而控制基础机制对特定转录因子结合的调控区域的访问。 CDK8活性参与多种信号通路，包括Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad、STAT和核激素受体通路。它通过磷酸化通路特异性转录因子和共调节因子，并调节其转录输出的幅度和持续时间，将细胞外信号和致癌信号与介导因子依赖性基因表达联系起来。CDK8激酶模块调控一系列参与代谢、细胞周期进程和细胞存活的基因，并通过转录调控凋亡和自噬基因以及细胞周期蛋白C在线粒体动力学中的非转录作用，在细胞生死抉择中发挥关键作用。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:30

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

53 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: K562, Lane 2: HCT116, Lane 3: SW480, Lane 4: Hela