COL3A1 Antibody (Rabbit mAb) [P18A14]

目录号：F3026

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生物描述

特异性 COL3A1 Antibody (Rabbit mAb) [P18A14] 可检测内源性 COL3A1 总蛋白水平。
背景 COL3A1基因编码III型胶原蛋白的α1(III)前体链。III型胶原蛋白是一种纤维状胶原蛋白，以同源三聚体的形式组装，并整合到皮肤、肺、肠、子宫和血管壁等可伸展软组织的细胞外基质中，形成分支状原纤维。在这些组织中，它经常与I型胶原蛋白共定位，并有助于维持组织的弹性和抗张强度。α1(III)链包含特征性的长三螺旋结构域，该结构域由连续的Gly-X-Y重复序列构成，两侧是非螺旋状的N端和C端前肽。细胞内三条α1(III)链组装成前胶原蛋白三螺旋后，在细胞外发生N端和C端前肽的切割，成熟的III型胶原蛋白整合到异型原纤维中，这些原纤维与蛋白聚糖、其他胶原蛋白和细胞表面受体相互作用。 III型胶原蛋白作为结构支架和I型胶原蛋白原纤维形成的调节因子发挥作用。基因缺失或功能缺陷会改变含I型胶原蛋白原纤维的直径和排列方式，损害外膜和心肌的结构，并扰乱正常的心血管发育，这凸显了COL3A1在协调原纤维组装以及动脉和心脏组织的生物力学行为方面的机制性作用。在动脉壁中，III型胶原蛋白主要定位于外膜和中膜，参与构成承载网络，以适应周期性拉伸并维持血管稳定性；III型胶原蛋白的丰度或质量改变会改变血管顺应性，并使其在血流动力学应力下更容易发生结构性损伤。 COL3A1基因的杂合致病变异会导致三螺旋区内甘氨酸残基的替换或胶原链的截短，从而引发血管型埃勒斯-当洛斯综合征。该病以动脉脆弱、自发性动脉夹层或破裂以及肠道和子宫等空腔器官的易损性为特征，反映了这些组织对完整的III型胶原网络的机械完整性的依赖性。由携带COL3A1突变的成纤维细胞生成的患者来源的细胞外基质显示出胶原组成改变、糖胺聚糖含量增加以及粘弹性改变（包括应力松弛减慢），这些改变会影响内皮细胞在基质上的迁移，并表明COL3A1状态、细胞外基质的力学行为和血管细胞相互作用之间存在直接联系。在纤维化疾病中，肺、肝、肾和皮肤等器官的基质重塑伴随着COL3A1表达升高和III型胶原沉积增加，导致间质支架增厚和组织硬度改变，进而影响驻留细胞的增殖、迁移和分化。在癌症中，肿瘤和基质成分中的COL3A1表达与细胞外基质重塑、血管生成信号传导和肿瘤细胞行为改变相关。肺腺癌中COL3A1阳性内皮细胞亚群表现出独特的代谢和免疫信号特征，通过VEGF和PI3K-AKT通路活性调控与恶性细胞的通讯。将重组人COL3A1应用于真皮成纤维细胞可促进细胞增殖、胶原蛋白生物合成和伤口愈合，并支持细胞外基质沉积，表明其在皮肤修复中发挥功能性作用，并凸显了该蛋白作为增强真皮再生和调节皮肤衰老相关基质退化的候选生物材料的价值。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:100 1:100 - 1:400
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 139 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IF

Validated by Selleck

  • Immunofluorescent analysis of RD cells using F3026 (green, 1:100 ), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (hCOL3A1 transfected)