Connexin 36 Antibody [L23J6]

目录号：F3937

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生物描述

特异性 Connexin 36 Antibody [L23J6] 可检测内源性 Connexin 36 总蛋白水平。
背景 连接蛋白 36 (Cx36, GJC1) 是一种神经元特异性间隙连接蛋白，在哺乳动物脑中间神经元和视网膜神经元中高表达，组装成六聚体连接子，其中每个单体具有四个跨膜结构域 (TM1–4)；TM1 和 TM2 形成孔道衬里的疏水收缩，两侧是含有保守的 d-脯氨酸 (Pro47, Pro187) 的细胞外环 (EL1/EL2)，这些保守的 d-脯氨酸有助于细胞间对接。该通道具有一个短的胞内N端尾部，其中包含CaMKII磷酸化位点（特别是Ser293），以及一个胞质环（CL）结构域，该结构域介导Ca²⁺/钙调蛋白结合，并通过变构作用调控直径约为15 Å的水孔，该水孔对分子量小于1.2 kDa的阳离子和阴离子（包括K⁺、IP₃、cAMP和荧光素黄）具有选择性通透性。Cx36间隙连接通道虽然对电压不敏感，但对pH值和Ca²⁺敏感，具有较低的单位电导（约15 pS），并通过允许胞体和树突之间的直流电流，介导双向电紧张耦合，从而实现抑制性网络中精确的脉冲同步。在突触可塑性过程中，Ser293位点的CaMKII依赖性磷酸化会增加通道开放概率；而甲氟喹和奎宁等药物则通过结合TM1/TM2单体间的疏水性口袋（I35/V38/A39/I40、I76/V80）来抑制通道电导，形成封闭环，使离子渗透通路脱水，从而降低电导超过50%。Cx36对于γ振荡、视交叉上核（SCN）昼夜节律起搏器的相位锁定以及视网膜中AII无长突细胞介导的视杆细胞通路信号传导至关重要；其敲除会破坏动作电位时序的精确性，损害视觉运动反射，并增加癫痫易感性。 R278H 等突变会破坏间隙连接斑块的稳定性，导致青少年肌阵挛性癫痫和眼齿指发育不良表型。

使用信息

抗体应用 IHC, IF 稀释比例
IHC IF
1:160-1:250 1:160-1:250
反应性 Human, Mouse
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IF

Validated by Selleck

  • Immunofluorescent analysis of Mouse eye tissue using F3937 (green, 1:160) and Hoechst (blue).