CUL3 Antibody (Rabbit mAb) [N12N7] Datasheet

生物描述

特异性	CUL3 Antibody (Rabbit mAb) [N12N7] 可检测内源性 CUL3 总蛋白水平。
背景	CUL3（Cullin-3）属于cullin支架蛋白家族，该家族蛋白组装Cullin-RING泛素连接酶（CRL）复合物，这是真核细胞中最大的E3连接酶家族。CUL3是八种不同的cullin基复合物之一，这些复合物的区别在于其底物识别模块。CUL3在其C端锚定RING指状催化蛋白Rbx1，使泛素化的E2结合酶定位，以便进行底物转移；同时，其N端结构域直接结合含有BTB（Bric-a-brac/Tramtrack/Broad complex）结构域的衔接蛋白，这些衔接蛋白同时也是底物受体。这种模块化结构无需单独的连接亚基，并将CUL3复合物与其他cullin-RING复合物区分开来。 BTB衔接蛋白将其保守的Cul3结合域与第二个可变结构域（例如Kelch结构域、MATH结构域、锌指结构域或PHR结构域）相结合，后者决定底物特异性。这种组合方式使得CUL3能够从单个支架上组装出多种不同的泛素连接酶复合物。BTB衔接蛋白还能够二聚化，从而允许两个CUL3分子整合到一个连接酶复合物中，这种构型与底物泛素化效率密切相关。连接酶的激活依赖于类泛素蛋白Nedd8与CUL3保守的C端赖氨酸残基的结合，这会重塑Rbx1 RING结构域并增加其构象灵活性，使E2酶与底物更接近，从而实现高效的泛素转移。通过这种机制，CUL3复合物指导蛋白酶体降解调控细胞周期进程、转录调控和发育分化的底物。在已鉴定的CUL3-BTB配对中，Keap1将CUL3与Nrf2连接，调控氧化应激反应；KLHL20将CUL3与包括PML和DAPK在内的底物连接，影响肿瘤抑制因子的周转；SPOP则引导CUL3活性靶向参与转录和信号调控的底物。这些衔接蛋白-底物关系的失调在多种人类癌症中均有发现，导致连接酶活性改变，并稳定或耗竭一些影响肿瘤进展和治疗反应的蛋白质。这种单衔接蛋白桥接设计，结合单个BTB蛋白的组织特异性表达，使得CUL3连接酶复合物成为一个易于研究的框架，可用于解析选择性蛋白降解途径，并识别特定生理或疾病表型背后的衔接蛋白-底物模块。这些信息对于研究人员选择CUL3相关靶点进行功能或治疗研究具有直接意义。

特异性

CUL3 Antibody (Rabbit mAb) [N12N7] 可检测内源性 CUL3 总蛋白水平。

背景

CUL3（Cullin-3）属于cullin支架蛋白家族，该家族蛋白组装Cullin-RING泛素连接酶（CRL）复合物，这是真核细胞中最大的E3连接酶家族。CUL3是八种不同的cullin基复合物之一，这些复合物的区别在于其底物识别模块。CUL3在其C端锚定RING指状催化蛋白Rbx1，使泛素化的E2结合酶定位，以便进行底物转移；同时，其N端结构域直接结合含有BTB（Bric-a-brac/Tramtrack/Broad complex）结构域的衔接蛋白，这些衔接蛋白同时也是底物受体。这种模块化结构无需单独的连接亚基，并将CUL3复合物与其他cullin-RING复合物区分开来。 BTB衔接蛋白将其保守的Cul3结合域与第二个可变结构域（例如Kelch结构域、MATH结构域、锌指结构域或PHR结构域）相结合，后者决定底物特异性。这种组合方式使得CUL3能够从单个支架上组装出多种不同的泛素连接酶复合物。BTB衔接蛋白还能够二聚化，从而允许两个CUL3分子整合到一个连接酶复合物中，这种构型与底物泛素化效率密切相关。连接酶的激活依赖于类泛素蛋白Nedd8与CUL3保守的C端赖氨酸残基的结合，这会重塑Rbx1 RING结构域并增加其构象灵活性，使E2酶与底物更接近，从而实现高效的泛素转移。通过这种机制，CUL3复合物指导蛋白酶体降解调控细胞周期进程、转录调控和发育分化的底物。在已鉴定的CUL3-BTB配对中，Keap1将CUL3与Nrf2连接，调控氧化应激反应；KLHL20将CUL3与包括PML和DAPK在内的底物连接，影响肿瘤抑制因子的周转；SPOP则引导CUL3活性靶向参与转录和信号调控的底物。这些衔接蛋白-底物关系的失调在多种人类癌症中均有发现，导致连接酶活性改变，并稳定或耗竭一些影响肿瘤进展和治疗反应的蛋白质。这种单衔接蛋白桥接设计，结合单个BTB蛋白的组织特异性表达，使得CUL3连接酶复合物成为一个易于研究的框架，可用于解析选择性蛋白降解途径，并识别特定生理或疾病表型背后的衔接蛋白-底物模块。这些信息对于研究人员选择CUL3相关靶点进行功能或治疗研究具有直接意义。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000-1:5000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

82 kDa, 84 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A204, Lane 2: A673, Lane 3: Neuro-2a, Lane 4: COS-7