CX3CR1 Antibody (Rabbit mAb) [G13H18]

目录号：F8794

打印

生物描述

特异性 CX3CR1 Antibody (Rabbit mAb) [G13H18] 可检测内源性 CX3CR1 总蛋白水平。
背景 CX3CR1 是一种七次跨膜 G 蛋白偶联趋化因子受体，属于 CX3C 家族，是趋化因子 fractalkine/CX3CL1 的同源受体，表达于部分免疫细胞和实质细胞群，包括单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、部分 CD8⁺ T 细胞、NK 细胞和平滑肌细胞。该受体可结合膜锚定型和可溶型 CX3CL1，其中 CX3CL1 的 N 端趋化因子结构域与 CX3CR1 的胞外环结合，而跨膜螺旋和胞内环则与异源三聚体 G 蛋白以及趋化因子 GPCR 典型的下游信号通路偶联。膜结合的CX3CL1激活CX3CR1，促进CX3CR1阳性白细胞在流动条件下与内皮细胞或上皮细胞牢固黏附，整合趋化因子受体信号、整合素激活和细胞骨架重组，从而稳定炎症部位或稳态监视微环境中的免疫细胞-组织接触。可溶性CX3CL1与CX3CR1结合，通过Gαi依赖性通路触发趋化信号传导，导致腺苷酸环化酶抑制、PI3K和小GTP酶激活以及肌动蛋白细胞骨架重组，从而支持单核细胞、T细胞、NK细胞和其他表达CX3CR1的细胞亚群向趋化因子梯度定向迁移。 CX3CL1-CX3CR1的相互作用还能激活CX3CR1⁺细胞中的存活和活化通路，包括PI3K-Akt和ERK级联反应，并影响细胞因子、细胞毒性介质和黏附分子的表达，从而将该轴与组织驻留和循环免疫细胞群的细胞滞留、效应细胞分化和抗凋亡能力联系起来。在神经系统中，小胶质细胞和神经元相关巨噬细胞上的CX3CR1与神经元上的CX3CL1结合，参与神经元-胶质细胞通讯，调节小胶质细胞的活化状态、突触修剪以及对损伤或神经退行性疾病的炎症反应。在炎症和感染性疾病中，CX3CL1-CX3CR1轴协调白细胞在组织内的募集、黏附和定位，并有助于维持动脉粥样硬化、自身免疫性疾病和慢性感染等疾病中保护性免疫和慢性炎症之间的平衡。 CX3CR1 也出现在富含效应和记忆样特征的 CX3CR1⁺ CD8⁺ T 细胞上，CX3CL1 的结合支持这些细胞归巢至组织、滞留在炎症或肿瘤部位，并参与抗肿瘤细胞毒性反应，这使得 CX3CR1 成为高功能细胞毒性 T 细胞亚群的标志物。CX3CR1 的基因变异或表达失调与心血管疾病、神经炎症性疾病和恶性肿瘤的易感性改变或疾病进展相关，这与其通过分形素依赖性趋化和黏附信号通路在控制白细胞迁移、存活和效应功能方面发挥的核心作用相一致。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:500-1:1000 1:500
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 40 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IF

Validated by Selleck

  • Immunofluorescent analysis of THP-1 cells using F8794 (green, 1:500), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: THP-1, Lane 2: Hela, Lane 3: SW480, Lane 4: HepG2