CXCL13 Antibody (Mouse mAb) [E8F3]

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生物描述

特异性 CXCL13 Antibody (Mouse mAb) [E8F3] 可检测内源性 CXCL13 总蛋白水平。
背景 CXCL13，又称B细胞趋化因子-1 (BCA-1) 或B淋巴细胞趋化因子 (BLC)，是一种CXC趋化因子，它驱动B细胞在次级淋巴器官和异位淋巴结构中的募集、定位和活化，并作为G蛋白偶联受体CXCR5的主要配体，参与组织淋巴结构和协调体液免疫反应。该趋化因子具有保守的CXC折叠结构，包含N端活化区、三链β折叠和C端α螺旋。它在滤泡树突状细胞和基质组织细胞上形成梯度，吸引表达CXCR5的B细胞和滤泡辅助性T细胞进入B细胞区，在那里发生生发中心反应和抗体亲和力成熟。 CXCL13 与 CXCR5 结合触发 Gαi 依赖性信号通路，进而激活 PI3K、MAPK 和小 GTP 酶，下游激活 Akt 和 Rac，重组肌动蛋白细胞骨架，并引导 B 细胞沿 CXCL13 梯度进行极化迁移。同时，CXCR5 还募集 β-arrestin 来调节受体转运和信号持续时间，将迁移与维持 B 细胞稳态和分化所需的存活和激活信号整合起来。CXCL13/CXCR5 轴通过将 CXCR5 阳性 B 细胞和滤泡辅助性 T 细胞募集到间充质淋巴组织组织细胞 (LMLTOC) 来发挥淋巴组织组织者的作用，促进慢性炎症、感染或自身免疫性疾病期间非淋巴组织中三级淋巴结构的形成。此外，在疾病状态下，外周辅助性 T 细胞和巨噬细胞表达 CXCL13 会驱动异位淋巴组织新生和病理性 B 细胞聚集。在癌症中，CXCL13/CXCR5 轴通过将 B 细胞、调节性 B 细胞和 T 滤泡辅助细胞募集到肿瘤相关的三级淋巴结构中来塑造肿瘤微环境，其活性可以通过吸引抑制性淋巴细胞来促进促肿瘤免疫抑制，同时通过有组织的生发中心样反应和高亲和力抗体产生来增强抗肿瘤免疫，CXCL13 还通过恶性细胞中的 PI3K/AKT 和 NF-κB 信号传导来驱动肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成。在自身免疫性疾病中，炎症组织中CXCL13的异位表达与CXCR5依赖的B细胞浸润、三级淋巴结构的形成、自身抗体的产生以及类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、干燥综合征、重症肌无力和炎症性肠病等疾病的慢性炎症密切相关，这使得CXCL13成为这些疾病的生物标志物和治疗靶点。此外，CXCL13还能被环境致癌物（如烟草烟雾和苯并[a]芘）诱导，在肺上皮细胞中表达，并促进肺癌和结直肠癌的发生。小鼠CXCL13基因敲除可降低这些致癌物驱动的恶性肿瘤的发生率，表明CXCL13以一种依赖于特定环境的方式参与免疫介导的肿瘤控制和肿瘤促进。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 13 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Recombinant (hFc) Human CXCL13 Protein