DIAPH1 Antibody (Rabbit mAb) [J8A16]

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生物描述

特异性 DIAPH1 Antibody (Rabbit mAb) [J8A16] 可检测内源性 DIAPH1 总蛋白水平。
背景 DIAPH1，也称为diaphanous相关formin 1，是一种Rho效应formin，作为肌动蛋白成核和延伸因子，是F-肌动蛋白结构（如肌动蛋白束和应力纤维）组装和维持所必需的，这些结构支撑着细胞的形状、收缩性和迁移能力。该蛋白包含N端GTP酶结合区、DID区和卷曲螺旋区，以及C端FH1、FH2和DAD基序。这些基序共同介导DIAPH1的自身抑制，并可通过激活的RhoA解除抑制。激活的RhoA可使FH2结构域结合肌动蛋白丝的带刺端，而富含脯氨酸的FH1区则募集profilin-肌动蛋白复合物，从而驱动肌动蛋白丝的延伸。 DIAPH1定位于细胞皮层、应力纤维和胞质分裂结构，在那里它控制肌动蛋白丝的生长并稳定F-肌动蛋白。它也存在于微管正端和细胞皮层，作为支架蛋白结合MAPRE1/EB1、APC、CLASP2和MACF1，从而在细胞迁移和极性建立过程中将微管捕获和稳定与皮层肌动蛋白网络相偶联。DIAPH1通过RhoA依赖性途径募集到细胞膜，并与Src家族激酶相互作用，使其参与协调肌动蛋白重塑和酪氨酸激酶通路的信号模块。同时，MEMO1-RHOA-DIAPH1轴通过调节GSK3β活性以及APC和CLASP2的皮层靶向定位，将ERBB2激活与细胞皮层的微管稳定联系起来。 DIAPH1在细胞核内也发挥作用，它促进核内肌动蛋白聚合，并支持血清依赖性的SRF-MRTFA转录程序的激活，从而在细胞骨架动力学和细胞骨架反应基因的转录调控之间建立直接联系。在内分泌细胞中，DIAPH1参与cAMP调节的运输和线粒体定位，因为DIAPH1的cAMP-ERK依赖性磷酸化调节其稳定性及其与驱动蛋白、动力蛋白-1、氧固醇结合蛋白、肌动蛋白和β-微管蛋白等伴侣蛋白的结合，这些伴侣蛋白在激素生成过程中调节细胞器沿肌动蛋白和微管轨道的运动。在多种组织中，DIAPH1 在细胞分裂、神经突生长、脑发育以及细胞整体形态和细胞骨架组织的调控中发挥着至关重要的作用。它参与内耳毛细胞中特殊肌动蛋白结构的形成，而 DIAPH1 的缺失与常染色体显性遗传性感觉神经性听力损失相关。在肝脏中，DIAPH1 通过调节 Rab5a 活性和 TGFβ 受体内吞作用，促进肝星状细胞的肌成纤维细胞活化，从而将该formin 与促纤维化的 TGFβ 信号通路以及纤维化反应中依赖于细胞骨架的内吞运输联系起来。在包括头颈部鳞状细胞癌在内的多种癌症中，DIAPH1 表达升高与 ATR/p53 相关机制导致的细胞凋亡减少以及细胞黏附和迁移能力增强相关，表明 DIAPH1 驱动的肌动蛋白-微管网络和信号复合物的协调作用有助于恶性细胞的存活和侵袭行为。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IHC IF FCM
1:1000-1:10000 1:50-1:100 1:50 1:50
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 141 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HCT116, Lane 2: HCT116 (DIAPH1 KO), Lane 3: PC-12, Lane 4: MCF7