DLAT Antibody (Rabbit mAb) [L23H19]

目录号：F1107

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生物描述

特异性 DLAT Antibody (Rabbit mAb) [L23H19] 可检测内源性 DLAT 总蛋白水平。
背景 DLAT（丙酮酸脱氢酶E2，PDH-E2，二氢硫辛酰乙酰转移酶）构成哺乳动物丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）的内部催化核心，它将糖酵解碳流整合到线粒体乙酰辅酶A的生成中，从而将碳水化合物氧化与柠檬酸循环和下游脂质生物合成偶联起来。PDH-E2属于2-酮酸脱氢酶家族，由多个相同的内部核心结构域组成十二面体结构，这些结构域为外周的E1（丙酮酸脱氢酶）和E3（二氢硫辛酰胺脱氢酶）以及哺乳动物PDC特有的E3结合蛋白（E3BP）提供支架，E3BP也嵌入到相同的核心结构中。每个E2多肽包含N端硫辛酰结构域和一个E1结合片段，这些片段通过柔性连接子与C端内部核心结构域相连。内核部分采用保守的α/β折叠，沿每个三重轴形成三聚体，这些三聚体沿二重轴进一步连接成一个空心十二面体笼状结构，使活性位点朝向内部和外部溶剂通道。在每个三聚体内部，两个相邻的E2亚基协同作用形成一个复合乙酰转移酶活性位点。其中一个亚基的丝氨酸残基和顺时针方向另一个亚基的组氨酸残基共同协调二氢硫辛酰基和辅酶A的结合和定位，引导乙酰基从还原的硫辛赖氨酸臂转移到辅酶A上，这一过程由E1启动的氧化脱羧反应进行。硫辛赖氨酸“摆臂”从外表面通过螺旋H1附近的狭窄通道接近E2通道，而辅酶A则通过另一个入口从内部空腔进入同一活性位点；外部、通道和内部表面的特定静电场有利于硫辛酰化结构域和辅酶A的有效引导，避免底物或产物的非特异性捕获。活性位点通道核心的βE和βF之间的可移动β转角缺乏有序密度，其位置使其能够作为动态闸门，调节脂酰和CoA配体的进入和释放，从而支持乙酰基转移与上游脱羧和下游NADH生成的紧密偶联。在双重界面上，C端螺旋形成疏水性“旋钮”，与配对三聚体上的互补“孔”对接；在人E2中，直的H2螺旋和末端H7螺旋重塑了这种相互作用，使其有利于更大的三聚体间角度，从而形成十二面体几何结构，而非其他家族成员中常见的立方体几何结构，这一特征决定了E1、E3和E3BP围绕核心的排列和调控方式。决定十二面体结构的结构表面也决定了脂酰结构域和调控蛋白如何接近核心，因此E2的内部结构直接影响底物通道效率、对丙酮酸脱氢酶激酶和磷酸酶的响应性，以及E1和E3活性整合到单个催化组装体中。E3BP中一个密切相关的核心结构域与E2具有高度的序列和结构相似性，并且可以在异源三聚体中占据等效位置，但缺少催化组氨酸；因此，E3BP保留了脂酰臂和CoA的底物结合决定簇，但改变了三聚体中一个活性位点的催化构型，从而形成混合的E2/E3BP三聚体，这些三聚体改变了局部乙酰转移酶活性和E3在核心周围的分布。建模和界面分析表明，含有两个E2和一个E3BP核心结构域的异源三聚体在能量上更有利，富含E3BP的界面比E2-E2接触更弱。这种结构支撑着一个核心，其中E3BP亚基以有限的、有规律的方式插入，既保持了整体十二面体几何结构，又调节了E3的募集和局部催化环境。通过这种模块化结构，PDH-E2不仅催化乙酰转移，还决定了催化中心和E3对接的空间模式，从而塑造了丙酮酸氧化的通量，并影响了PDC对营养物质供应、氧化还原平衡以及通过丙酮酸脱氢酶激酶和磷酸酶传递信号的激素输入的响应。由E2核心支持的丙酮酸不可逆转化为乙酰辅酶A是哺乳动物能量代谢中的一个主要调控点，而由于E2、E3BP或其组装缺陷导致的PDC整体功能下降，会导致氧化代谢受损、丙酮酸和乳酸积累，以及与乳酸性酸中毒和其他代谢紊乱相关的神经功能障碍。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IP IHC IF FCM
1:1000-1:10000 1:10-1:100 1:500-1:1000 1:50-1:100 1:10-1:100
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 69 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela, Lane 2: HepG2, Lane 3: RAW 264.7, Lane 4: C6