DNAJA1 Antibody [J3K12] Datasheet

生物描述

特异性	DNAJA1 Antibody [J3K12] 可检测内源性 DNAJA1 总蛋白水平。
背景	DNAJA1（DnaJ同源亚家族A成员1）是一种胞质I型Hsp40辅助伴侣蛋白，对蛋白质稳态和应激信号传导至关重要。它包含一个N端J结构域（氨基酸残基4-70，其中His33-Pro34-Asp35处的HPD基序对Hsp70 ATPase的激活至关重要）、一个C4锌指结构域（氨基酸78-115，包含八个半胱氨酸，可与两个Zn²⁺离子配位以探测底物蛋白上的疏水区域）、一个富含甘氨酸/苯丙氨酸的柔性连接区（氨基酸116-165）以及一个C端底物结合结构域（氨基酸166-397），该结构域由堆叠的β折叠和α螺旋组成，此外还有一个法尼基化的CTIL355-358基序，用于动态锚定到内质网或质膜上。在Hsp70分子伴侣循环中，J结构域的α螺旋II与Hsp70的核苷酸结合结构域对接，使ATP水解速度提高1000倍以上，并将底物捕获在ADP结合状态。锌指结构域递送多种底物，例如构象突变型p53（其中DNAJA1结合mutp53核心结构域，通过空间位阻阻断Lys620位点的CHIP E3泛素化，稳定致癌构象，从而通过Cdc42/Rac1介导的丝状伪足驱动胰腺癌和胆管癌的侵袭）、CFTR ΔF508（通过Hsc70指导内质网滞留和逆向转位）、tau蛋白原纤维（促进Hsp104非依赖性解聚）以及流感病毒PB2/PA核输入复合物。 DNAJA1还能通过促进Hsc70介导的SAPK螯合来抑制氧化应激和内质网应激下的JNK/c-Jun过度激活，从而阻止BAX介导的线粒体外膜通透性增加和细胞凋亡。此外，它还能调节亨廷顿病模型中的polyQ-htt聚集和hERG通道的转运。然而，在胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤中，DNAJA1的下调反而会增加突变型p53的持续存在和肿瘤生长，使这些肿瘤对J结构域抑制剂（例如A11，其靶向Y7/K44/Q47以破坏突变型p53的相互作用并促进其蛋白酶体清除）更加敏感。

特异性

DNAJA1 Antibody [J3K12] 可检测内源性 DNAJA1 总蛋白水平。

背景

DNAJA1（DnaJ同源亚家族A成员1）是一种胞质I型Hsp40辅助伴侣蛋白，对蛋白质稳态和应激信号传导至关重要。它包含一个N端J结构域（氨基酸残基4-70，其中His33-Pro34-Asp35处的HPD基序对Hsp70 ATPase的激活至关重要）、一个C4锌指结构域（氨基酸78-115，包含八个半胱氨酸，可与两个Zn²⁺离子配位以探测底物蛋白上的疏水区域）、一个富含甘氨酸/苯丙氨酸的柔性连接区（氨基酸116-165）以及一个C端底物结合结构域（氨基酸166-397），该结构域由堆叠的β折叠和α螺旋组成，此外还有一个法尼基化的CTIL355-358基序，用于动态锚定到内质网或质膜上。在Hsp70分子伴侣循环中，J结构域的α螺旋II与Hsp70的核苷酸结合结构域对接，使ATP水解速度提高1000倍以上，并将底物捕获在ADP结合状态。锌指结构域递送多种底物，例如构象突变型p53（其中DNAJA1结合mutp53核心结构域，通过空间位阻阻断Lys620位点的CHIP E3泛素化，稳定致癌构象，从而通过Cdc42/Rac1介导的丝状伪足驱动胰腺癌和胆管癌的侵袭）、CFTR ΔF508（通过Hsc70指导内质网滞留和逆向转位）、tau蛋白原纤维（促进Hsp104非依赖性解聚）以及流感病毒PB2/PA核输入复合物。 DNAJA1还能通过促进Hsc70介导的SAPK螯合来抑制氧化应激和内质网应激下的JNK/c-Jun过度激活，从而阻止BAX介导的线粒体外膜通透性增加和细胞凋亡。此外，它还能调节亨廷顿病模型中的polyQ-htt聚集和hERG通道的转运。然而，在胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤中，DNAJA1的下调反而会增加突变型p53的持续存在和肿瘤生长，使这些肿瘤对J结构域抑制剂（例如A11，其靶向Y7/K44/Q47以破坏突变型p53的相互作用并促进其蛋白酶体清除）更加敏感。

使用信息

抗体应用

WB, FCM

稀释比例

WB	FCM
1:10000 - 1:50000	1:10 - 1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

45 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: HepG2, Lane 2: SK-BR-3, Lane 3: Jurkat, Lane 4: Raji