E2A Antibody [E15P20]

目录号：F4301

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生物描述

特异性 E2A Antibody [E15P20] 可检测内源性 E2A 总蛋白水平。
背景 E2A，又称TCF3，是碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子E蛋白家族的成员，与E2-2和HEB同属该家族。E2A基因座的选择性剪接产生E12和E47两种亚型，它们都包含N端转录激活结构域AD1（氨基酸残基1-100，具有PCET基序）、AD2（包含LDEAI序列）、AD3（221-300）和DES，以及负责二聚化和DNA结合的C端bHLH结构域（氨基酸残基547-608）。 bHLH结构域包含一个识别E-box CANNTG基序的碱性区域（Arg547–Val559）、螺旋1（Arg560–Leu577）、一个环（Lys578–Thr584）和螺旋2，其中Glu600在同源二聚体形成（优先结合CACCTG基序）或与组织特异性bHLH伴侣（如MyoD，优先结合CATCTG基序）形成异源二聚体的过程中发挥关键的氢键作用。E47由于螺旋间相互作用更强而更倾向于形成同源二聚体，而E12则更易形成异源二聚体。E2A介导的转录激活涉及AD1将疏水性残基插入CBP/p300的KIX/TAZ2结构域，从而募集组蛋白乙酰转移酶，在B细胞谱系分化过程中打开免疫球蛋白增强子处的染色质。 AD2通过LDEAI基序与CBP KIX协同结合，进一步增强基因激活；而N2B基序（Pro187、Pro191、Ser192）则与ETO NHR2结构域结合，通过募集HDACs进行共抑制，从而沉默前B细胞中的Nfil3和FGFR2等基因。AD3与TFIID中的TAF3的TAFH4相互作用，增强TATA盒结合和RNA聚合酶II募集，从而调控谱系特异性基因的表达。E2A对B淋巴细胞生成至关重要，它激活Mb-1、Pax5和Rag等靶基因，从而促进B细胞定向分化并抑制髓系或红系分化；E2A敲除小鼠缺乏前B细胞阶段之后的B细胞。在肌肉发育过程中，E2A-MyoD/肌生成素异二聚体结合肌生成素和结蛋白启动子中的E-box，促进终末分化。 ChIP-seq结果表明，E2A平衡了激活和抑制两种功能：它直接结合于前B细胞增强子（激活）和基因间区（抑制）。在生发中心，E2A与E2-2共同作用，通过AID维持暗区特性并促进体细胞高频突变。E2A缺乏会破坏中枢耐受性，从而增加自身免疫风险；而E2A过表达则会增强糖皮质激素治疗的敏感性。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:100-1:1000 1:200-1:400 1:50-1:500
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 67 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Jurkat, Lane 2: MOLT-4, Lane 3: K562, Lane 4: NIH/3T3