EGR2 Antibody (Rabbit mAb) [E12D8] Datasheet

生物描述

特异性	EGR2 Antibody (Rabbit mAb) [E12D8] 可检测内源性 EGR2 总蛋白水平。
背景	EGR2，又名KROX20，是一种锌指转录因子，在周围神经系统发育过程中，作为关键的主调控因子，控制着雪旺细胞从髓鞘形成早期向髓鞘生成活跃期的转变。EGR2的表达本身在这一发育转变过程中被诱导，其机制是通过位于转录起始位点下游的髓鞘形成雪旺细胞增强子元件。该增强子的激活需要POU结构域转录因子Oct6和Brn2以及高迁移率族转录因子Sox10之间的协同作用，每个因子都需要独立结合其自身的DNA位点，而不是通过共享的复合元件。此外，Sox10还与该增强子内的多个主要为单体的结合位点结合，这种构型使得EGR2的诱导对Sox10的剂量高度敏感。 EGR2一旦表达，便通过直接结合主要髓鞘基因的调控元件（包括髓鞘蛋白零的内含子元件）来驱动髓鞘形成转录程序。这种结合需要与Sox10协同作用，Sox10通过同一调控元件内的相邻结合位点发挥作用。这种构型也存在于连接蛋白32、髓鞘碱性蛋白和髓鞘相关糖蛋白基因中。EGR2活性受到NAB家族共抑制因子的直接负调控。NAB家族共抑制因子募集NuRD染色质重塑复合物来减弱EGR2驱动的转录激活，从而提供一种反馈机制，调节髓鞘形成转录反应的强度，而不是允许靶基因不受限制地激活。导致周围髓鞘病的显性人类EGR2突变集中在DNA结合域的三个锌指结构域内，通常会损害EGR2的DNA结合能力；而另一种隐性突变则特异性地破坏NAB结合域。对神经病相关EGR2突变体的功能分析表明，至少有一部分突变体并不损害EGR2自身的DNA结合能力，而是选择性地减弱Sox10向共享调控元件的募集，从而解耦完全诱导髓鞘蛋白零表达所需的EGR2-Sox10协同机制。另一种影响异亮氨酸268的种系突变，特异性地破坏EGR2-NAB相互作用而不影响DNA结合，在小鼠模型中导致先天性髓鞘形成不足性神经病，且病程呈双相性。这直接证明，NAB介导的反馈抑制的丧失，即使与EGR2 DNA结合能力的任何缺陷无关，也足以导致周围髓鞘病变。

特异性

EGR2 Antibody (Rabbit mAb) [E12D8] 可检测内源性 EGR2 总蛋白水平。

背景

EGR2，又名KROX20，是一种锌指转录因子，在周围神经系统发育过程中，作为关键的主调控因子，控制着雪旺细胞从髓鞘形成早期向髓鞘生成活跃期的转变。EGR2的表达本身在这一发育转变过程中被诱导，其机制是通过位于转录起始位点下游的髓鞘形成雪旺细胞增强子元件。该增强子的激活需要POU结构域转录因子Oct6和Brn2以及高迁移率族转录因子Sox10之间的协同作用，每个因子都需要独立结合其自身的DNA位点，而不是通过共享的复合元件。此外，Sox10还与该增强子内的多个主要为单体的结合位点结合，这种构型使得EGR2的诱导对Sox10的剂量高度敏感。 EGR2一旦表达，便通过直接结合主要髓鞘基因的调控元件（包括髓鞘蛋白零的内含子元件）来驱动髓鞘形成转录程序。这种结合需要与Sox10协同作用，Sox10通过同一调控元件内的相邻结合位点发挥作用。这种构型也存在于连接蛋白32、髓鞘碱性蛋白和髓鞘相关糖蛋白基因中。EGR2活性受到NAB家族共抑制因子的直接负调控。NAB家族共抑制因子募集NuRD染色质重塑复合物来减弱EGR2驱动的转录激活，从而提供一种反馈机制，调节髓鞘形成转录反应的强度，而不是允许靶基因不受限制地激活。导致周围髓鞘病的显性人类EGR2突变集中在DNA结合域的三个锌指结构域内，通常会损害EGR2的DNA结合能力；而另一种隐性突变则特异性地破坏NAB结合域。对神经病相关EGR2突变体的功能分析表明，至少有一部分突变体并不损害EGR2自身的DNA结合能力，而是选择性地减弱Sox10向共享调控元件的募集，从而解耦完全诱导髓鞘蛋白零表达所需的EGR2-Sox10协同机制。另一种影响异亮氨酸268的种系突变，特异性地破坏EGR2-NAB相互作用而不影响DNA结合，在小鼠模型中导致先天性髓鞘形成不足性神经病，且病程呈双相性。这直接证明，NAB介导的反馈抑制的丧失，即使与EGR2 DNA结合能力的任何缺陷无关，也足以导致周围髓鞘病变。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000-1:10000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

50 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: LnCap, Lane 2: HepG2, Lane 3: MCF7, Lane 4: SH-SY5Y