Endothelin 1 Antibody (Mouse mAb) [F2J1]

目录号：F1613

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生物描述

特异性 Endothelin 1 Antibody (Mouse mAb) [F2J1] 可检测内源性 Endothelin 1 总蛋白水平。
背景 内皮素1 (ET-1) 是内皮素肽家族的主要亚型，是一种强效血管收缩剂，主要由血管内皮细胞产生。它在血管内皮细胞中发挥自分泌和旁分泌调节作用，影响血管张力、心脏负荷和局部组织灌注。该肽由较大的前体内皮素生成，前体经弗林蛋白酶样转化酶加工成大内皮素1 (big ET-1)，后者再经内皮素转化酶或糜蛋白酶-脑啡肽酶途径切割，最终生成成熟的活性肽。这一过程包含多个受调控的加工步骤，从而决定了ET-1在血管壁以及肾脏、肺和心脏等器官中的时空分布。成熟的内皮素-1 (ET-1) 肽与两种 G 蛋白偶联受体 ETA 和 ETB 结合。ETA 主要位于血管平滑肌细胞上，而 ETB 则存在于内皮细胞和平滑肌细胞上。受体激活主要与 Gq/11 偶联，刺激磷脂酶 C 的活性，促进肌醇 1,4,5-三磷酸的生成和 Ca²⁺ 的动员，从而导致平滑肌持续收缩并改变动脉和静脉阻力。ET-1 受体信号通路还参与其他途径，包括表皮生长因子受体反式激活、Rho 激酶激活、氧化应激诱导和腺苷酸环化酶活性调节，这些途径将 ET-1 的作用扩展到血管重塑、细胞增殖、细胞外基质生成以及心肌和血管平滑肌钙离子处理的改变。在阻力动脉和肺血管中，ETA介导的信号传导驱动缓慢起效、持续时间长的血管收缩，这种收缩主要依赖于Ca²⁺通过受体和储库操纵通道的内流，其次依赖于细胞内储库的释放。而内皮细胞上的ETB受体则促进一氧化氮和前列环素的释放，从而抵消血管收缩，这表明受体分布决定了ET-1在特定血管床中的净功能结果。ET-1的产生受血流动力学和体液因素的影响，例如剪切应力、缺氧、血管紧张素II、血管加压素、儿茶酚胺、生长因子和炎症细胞因子，并受到内皮一氧化氮、cGMP和利钠肽的负调控。这些因子共同将ET-1整合到更广泛的网络中，从而控制血管稳态和体液电解质平衡。内皮素-1 (ET-1) 水平升高和内皮素A/内皮素B (ETA/ETB) 信号通路增强是系统性高血压、肺动脉高压、心力衰竭和动脉粥样硬化性血管疾病的特征。在这些疾病中，ET-1 会导致血管阻力增加、血管中层肥厚、外膜纤维化、内皮功能障碍和炎症激活。ET-1 还能促进血管平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖和基质生成，并刺激肺成纤维细胞中白细胞介素-11 (IL-11) 等促纤维化介质的产生。这些都表明，ET-1 与肺血管和间质的结构重塑以及包括肺动脉高压、慢性肺病和心脏重塑在内的多种疾病进程密切相关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IHC IF FCM
1:100-1:1000 1:250 1:200-1:1000 1:5000
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 24 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: NIH/3T3