ERCC1 Antibody [E18K16]

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生物描述

特异性 ERCC1 Antibody [E18K16] 可检测内源性 ERCC1 总蛋白水平。
背景 ERCC1（切除修复交叉互补蛋白 1）是一种非催化支架蛋白，是结构特异性核酸内切酶复合物 ERCC1–XPF（ERCC4）所必需的。ERCC4 在核苷酸切除修复 (NER) 过程中执行精确的 5′ 切口，用于修复大体积 DNA 损伤，例如紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体和化学加合物；此外，ERCC4 还参与链间交联 (ICL) 解钩和通过同源重组处理双链断裂 (DSB) 中间体。 ERCC1（约297个氨基酸）包含一个N端XPF结合域（氨基酸残基1-211），该域含有介导异二聚化的β发夹和螺旋基序；一个中央DNA结合域，该域含有一个保守的[4Fe-4S]簇，该簇由关键的半胱氨酸残基配位，用于识别损伤；以及一个C端螺旋-发夹-螺旋(HhH)₂基序（氨基酸残基约220-289），该基序具有关键的精氨酸和赖氨酸残基，能够抓住切口位点3'端约5个核苷酸处的单链DNA。这种结构使ERCC1-XPF能够在DNA气泡、DNA瓣或霍利迪连接的分支点进行切割。 ERCC1通过异二聚体界面上的变构传递，将其催化核心定位在距可切割磷酸二酯键约40 Å处，从而为XPF的核酸酶活性提供支架，并在XPA和RPA包被的单链DNA背景下验证损伤，进而防止脱靶切割。在核苷酸切除修复（NER）中，ERCC1-XPF与XPG协同作用，产生双切口，切除约24-32个核苷酸的含损伤寡核苷酸，随后通过聚合酶和连接酶介导的缺口填充。在链间交联（ICL）修复中，该复合物与SLX4/MUS81/FAN1协同作用，在交联5'端切开亲本链，从而实现解链、跨损伤合成和同源重组（HR）介导的模板修复；它还能解析后期DNA桥和切除的双链断裂（DSB）瓣，以抑制基因组不稳定性。与疾病相关的表型包括 ERCC1 功能减弱突变，由于 NER 和 ICL 修复缺陷而导致加速衰老样综合征，而肿瘤（如 NSCLC、卵巢癌和结直肠癌）中 ERCC1 表达升高，通过加速清除药物诱导的 DNA 加合物而赋予对铂类化疗药物的耐药性。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 1:125
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 39 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

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