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生物描述
| 特异性 | FABP5 Antibody (Rabbit mAb) [N18C4] 可检测内源性 FABP5 总蛋白水平。 |
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| 背景 | 脂肪酸结合蛋白5 (FABP5/E-FABP) 是一种小型胞质脂质伴侣蛋白，属于FABP家族，它能结合长链脂肪酸和其他疏水性配体，并将它们定向转运至特定的细胞内靶点，从而调控表皮、脂肪组织、巨噬细胞和肝脏等组织中的脂质代谢、信号传导和炎症反应。该蛋白具有FABP家族特有的β桶状结构，其内部疏水性口袋可容纳饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，在某些情况下还能容纳视黄酸，这使得FABP5既能作为转运蛋白，又能作为信号辅助因子，将配体递送至包括PPARβ/δ和PPARγ在内的核受体。在脂肪细胞和癌细胞中，FABP5通过维持激素敏感性脂肪酶、单酰甘油脂肪酶、Elovl6和ACSL1等酶的表达，促进脂肪分解和脂肪酸从头合成；敲低FABP5会降低这些基因的表达，改变脂滴的周转，并减少用于β-氧化和膜合成的脂肪酸供应，表明FABP5通过调节脂质的数量和质量来支持细胞的生长、存活和侵袭能力。在前列腺癌和乳腺癌模型中，高表达的FABP5通过活性氧和PKC依赖性机制驱动NF-κB通路激活，增加炎症细胞因子的产生，并将脂质代谢的改变与促炎、促肿瘤信号通路联系起来。FABP5还通过与PPARγ的协同作用来协调巨噬细胞的程序化：FABP5结合并递送激活PPARγ的配体，这两种蛋白在一个正反馈回路中相互调节彼此的表达和活性，从而促进巨噬细胞向促消退表型转化；而FABP5缺陷则使巨噬细胞偏向促炎状态，伴有AMPK/NF-κB信号通路的改变和肺部炎症消退受损。在视黄酸信号传导的背景下，FABP5 与 RA 分子伴侣 CRABP-II 竞争 RA 结合；在 FABP5 高而 CRABP-II 低的细胞中，RA 优先递送至 PPARβ/δ 以促进存活和增殖，而在 CRABP-II 高而 FABP5 低的细胞中，RA 被定向至 RAR 以诱导分化和生长停滞，在急性髓系白血病中实验性抑制或敲低 FABP5 可将 RA 重新定向至 RAR 信号传导，使细胞对 ATRA 治疗敏感并减少白血病生长。在视网膜色素上皮细胞中，FABP5敲低会降低细胞胆固醇和胆固醇酯水平，增加游离脂肪酸和甘油三酯水平，减少载脂蛋白B100的分泌，并改变磷脂种类，这表明FABP5在脂质包装成脂蛋白样颗粒的过程中发挥着关键作用，并提示视网膜色素上皮细胞中FABP5的年龄相关性下调可能导致脂质积累和早期黄斑变性。在肝癌中，脂肪酸诱导的FABP5上调与HIF-1α形成功能轴；油酸刺激FABP5/HIF-1α活性，重编程脂质代谢，促进脂质积累，并增强肝细胞癌细胞的增殖，进一步阐明了FABP5如何将环境脂质的可用性与致癌代谢途径联系起来。最近在缺氧性脑损伤中的研究发现，FABP5是一种稳定的铁死亡相关标志物，它在细胞表面稳定存在，并在铁依赖性脂质过氧化过程中特异性升高。异位表达和脂质组学表明，FABP5 可重新分布氧化还原敏感脂质，并增加铁死亡敏感性，为中风和缺氧人脑组织中的铁死亡神经元提供功能性生物标志物。 |
使用信息
| 抗体应用 | WB, IHC, IF | 稀释比例 |
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| 反应性 | Human | ||||||||
| 抗体类型 | Rabbit Monoclonal Antibody | MW | 15 kDa | ||||||
| 储存液配方 | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | 储存条件 (自收到货起) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||||
| WB |
实验步骤： 样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表 湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
抗体孵育 1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
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| IHC |
实验步骤：
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
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| IF |
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
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文献参考
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Application Data
WB
Validated by Selleck
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Lane 1: Hela, Lane 2: PC-3, Lane 3: MDA-MB-231