fetal hemoglobin Antibody [E16B15]

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生物描述

特异性 fetal hemoglobin Antibody [E16B15] 可检测内源性 fetal hemoglobin 总蛋白水平。
背景 胎儿血红蛋白 (HbF) 是珠蛋白家族中一种运输氧气的四聚体血红蛋白，主要存在于妊娠10-12周至婴儿早期的胎儿红细胞中。HbF 由两条α-珠蛋白链（每条链含141个氨基酸残基，分别由HBA1/HBA2基因编码）和两条γ-珠蛋白链（每条链含146个氨基酸残基，分别由HBG1/HBG2基因编码，二者在第136位氨基酸残基上存在差异：HBG1为丙氨酸，HBG2为甘氨酸）组成。这形成了一个含有四个血红素基团的异源四聚体，其中γ亚基取代了成人β链的位置。HbF的一个关键特征是其对2,3-二磷酸甘油酸 (2,3-BPG) 的亲和力降低，这是由于γ-珠蛋白链中第143位氨基酸残基被丝氨酸取代（成人HbA中的第143位氨基酸残基为组氨酸）。这导致HbF对BPG的亲和力降低10倍，氧解离曲线左移（HbF的P50约为19 mmHg，而HbA为26 mmHg），使得HbF能够以更高的亲和力结合氧。加之胎儿血细胞比容较高（150–170 g/L），这使得氧气能够高效地跨胎盘转移，因为母体HbA释放氧气，而胎儿HbF则迅速吸收氧气。这一过程还受到双重波尔效应（胎儿PCO2下降增加HbF对氧的亲和力）和双重霍尔丹效应（氧合的HbF释放CO2，使母体HbA脱氧，从而吸收更多CO2）的增强。出生时，HbF占总血红蛋白的90%以上，但出生后由于BCL11A和KLF1介导的HBG1/2抑制以及β-珠蛋白基因（HBB）的激活，HbF会转变为成人型，并在6个月大时完成转变。在镰状细胞病和β-地中海贫血中，由于BCL11A或ZBTB7A缺失或HBG2启动子突变导致的遗传性HbF持续存在（HPFH）可通过抑制HbS聚合和平衡珠蛋白链的生成来缓解症状。治疗性HbF诱导可改善这些疾病的临床结局。由于HBA2在α链合成中起主导作用，α-地中海贫血突变对HbF的影响尤为显著。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:30 1:50 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 16 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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