Fez1 Antibody (Rabbit mAb) [F20M11]

目录号：F6880

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生物描述

特异性 Fez1 Antibody (Rabbit mAb) [F20M11] 可检测内源性 Fez1 总蛋白水平。
背景 FEZ1是秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）蛋白UNC-76的哺乳动物同源基因。UNC-76最初因其在轴突生长和束状化中的作用而被鉴定。随后，研究人员通过酵母双杂交筛选，发现FEZ1是蛋白激酶Cζ（PKCζ）调控结构域的特异性结合蛋白，从而确定FEZ1是PKCζ信号通路的直接下游靶点。在COS-7细胞中，FEZ1存在于胞质和膜结合两种定位的蛋白池中。PKCζ对FEZ1的磷酸化作用驱动膜结合部分向胞质的重新分布。而在PC12细胞中，同样的PKCζ依赖性FEZ1磷酸化作用则刺激神经突生长，从而将单个磷酸化事件与亚细胞定位和神经元分化行为的特定变化直接联系起来。 FEZ1 在结构上作为二价货物适配器发挥作用，通过其 N 端区域形成同源二聚体，同时通过其 C 端区域与驱动蛋白和其他货物相关伙伴结合；核磁共振分析表明，这种 N 端同源二聚化发生在两条 FEZ1 链呈反平行拓扑结构的情况下，生化表征证实，二聚体通过在二聚化界面内特定半胱氨酸残基处形成的分子间二硫键进一步稳定。这种二价衔接蛋白结构在功能上与秀丽隐杆线虫的 UNC-76 蛋白保守，因为 UNC-76 也同样直接与传统驱动蛋白重链的 C 端尾部结构域结合，在体内形成稳定的复合物，而 UNC-76 功能的丧失会导致运动和轴突运输缺陷，其表型与驱动蛋白功能丧失突变体相似。此外，UNC-76 还表现出与驱动蛋白重链和驱动蛋白轻链突变体剂量敏感的遗传相互作用，这些都表明 UNC-76/FEZ1 和驱动蛋白-1 在一个共享的、机制耦合的运输途径中发挥作用，而不是通过独立的、平行的途径。利用交联质谱、小角 X 射线散射和计算建模，FEZ1-SCOCO 衔接蛋白复合物鉴定出一个与之前在秀丽隐杆线虫中 UNC-76-UNC-69 复合物中证明的相互作用界面一致的相互作用界面，这一证据支持运输机制的异源四聚体组装模型，表明 FEZ1 将多个衔接蛋白伙伴募集到一个高级复合物中，而不是仅仅作为单体或二聚体驱动蛋白连接子发挥作用。

使用信息

抗体应用 WB, FCM, ELISA 稀释比例
WB FCM
1:1000 1:500
反应性 Human, Rat, Mouse
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 45 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain