FKBP5 Antibody (Rabbit mAb) [J11H16] Datasheet

生物描述

特异性	FKBP5 Antibody (Rabbit mAb) [J11H16] 可检测内源性 FKBP5 总蛋白水平。
背景	FKBP5，又称FKBP51，是一种免疫亲和素家族成员，具有肽基脯氨酰异构酶活性和辅助伴侣蛋白功能，可在内分泌和炎症控制的交界处调节类固醇激素受体信号传导、应激轴调控和激酶通路。该蛋白包含一个N端FK1结构域，具有顺反式脯氨酰异构酶活性和FK506/雷帕霉素结合活性；一个主要发挥支架功能的FK2样结构域；以及一个C端区域，该区域含有四肽重复序列基序，介导与HSP90的结合，并与糖皮质激素、孕激素、雄激素和盐皮质激素受体组装成多伴侣蛋白复合物。FKBP5与HSP90结合的糖皮质激素受体（GR）复合物结合，降低配体亲和力和GR核转位效率，导致受体对激素的敏感性降低。糖皮质激素受体（GR）激活后，通过内含子糖皮质激素反应元件诱导FKBP5转录，从而在GR信号传导和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴反馈上形成一个超短的负反馈环路。该自调节回路影响全身皮质醇动态，因为GR激活后FKBP5上调更强的等位基因与GR抵抗性增强、反馈抑制减弱以及人类应激激素水平持续升高相关。FKBP5还作为激酶信号传导的支架蛋白：它通过其FK1结构域与AKT结合，并通过TPR基序与磷酸酶PHLPP结合，促进二者相互作用，并促进AKT在Ser473位点的去磷酸化，从而限制AKT活性，并将FKBP5的丰度与PI3K-Akt通路输出和细胞存活信号传导联系起来。在炎症和心血管调控层面，FKBP5的表达受衰老和慢性应激的表观遗传和转录调控上调，增强NF-κB相关信号通路，并与促炎状态和心血管风险增加相关，表明FKBP5将应激内分泌机制与先天免疫激活和血管病理联系起来。FKBP5基因座的遗传和表观遗传变异，包括功能性多态性和应激反应性DNA甲基化改变，与FKBP5诱导性改变、下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）反应性改变以及对重度抑郁症、创伤后应激障碍、双相情感障碍和相关应激诱发精神疾病的易感性相关，这些变异还会影响抗抑郁治疗的反应率。

特异性

FKBP5 Antibody (Rabbit mAb) [J11H16] 可检测内源性 FKBP5 总蛋白水平。

背景

FKBP5，又称FKBP51，是一种免疫亲和素家族成员，具有肽基脯氨酰异构酶活性和辅助伴侣蛋白功能，可在内分泌和炎症控制的交界处调节类固醇激素受体信号传导、应激轴调控和激酶通路。该蛋白包含一个N端FK1结构域，具有顺反式脯氨酰异构酶活性和FK506/雷帕霉素结合活性；一个主要发挥支架功能的FK2样结构域；以及一个C端区域，该区域含有四肽重复序列基序，介导与HSP90的结合，并与糖皮质激素、孕激素、雄激素和盐皮质激素受体组装成多伴侣蛋白复合物。FKBP5与HSP90结合的糖皮质激素受体（GR）复合物结合，降低配体亲和力和GR核转位效率，导致受体对激素的敏感性降低。糖皮质激素受体（GR）激活后，通过内含子糖皮质激素反应元件诱导FKBP5转录，从而在GR信号传导和下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴反馈上形成一个超短的负反馈环路。该自调节回路影响全身皮质醇动态，因为GR激活后FKBP5上调更强的等位基因与GR抵抗性增强、反馈抑制减弱以及人类应激激素水平持续升高相关。FKBP5还作为激酶信号传导的支架蛋白：它通过其FK1结构域与AKT结合，并通过TPR基序与磷酸酶PHLPP结合，促进二者相互作用，并促进AKT在Ser473位点的去磷酸化，从而限制AKT活性，并将FKBP5的丰度与PI3K-Akt通路输出和细胞存活信号传导联系起来。在炎症和心血管调控层面，FKBP5的表达受衰老和慢性应激的表观遗传和转录调控上调，增强NF-κB相关信号通路，并与促炎状态和心血管风险增加相关，表明FKBP5将应激内分泌机制与先天免疫激活和血管病理联系起来。FKBP5基因座的遗传和表观遗传变异，包括功能性多态性和应激反应性DNA甲基化改变，与FKBP5诱导性改变、下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）反应性改变以及对重度抑郁症、创伤后应激障碍、双相情感障碍和相关应激诱发精神疾病的易感性相关，这些变异还会影响抗抑郁治疗的反应率。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

51 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: HT1080, Lane 2: Hela