FMNL2 Antibody (Mouse mAb) [A6K4] Datasheet

生物描述

特异性	FMNL2 Antibody (Mouse mAb) [A6K4] 可检测内源性 FMNL2 总蛋白水平。
背景	FMNL2 是一种与 diaphanous 相关的 formin 蛋白，它作为 Rho 家族 GTP 酶的效应分子和上游调节因子发挥作用，并在上皮和肿瘤环境中作为肌动蛋白依赖性过程（包括细胞形态、运动、侵袭和血管生成）的核心调控因子。该蛋白包含 N 端 GTP 酶结合域和 FH3 调节域、富含脯氨酸的片段以及 C 端 FH1 和 FH2 肌动蛋白组装结构域。这些结构域共同支持自身抑制的二聚体形成，该二聚体在 Rho 家族信号激活后，在皮层细胞骨架和前缘成核并延伸未分支的肌动蛋白丝。FMNL2 在细胞皮层和突起结构中富集，促进皮层肌动蛋白丝的动态变化、丝状伪足的形成和应力纤维的组织，从而塑造细胞极性、片状伪足结构以及驱动细胞向前运动和基质侵袭的牵引力。在结直肠癌中，FMNL2在转移性细胞系和肿瘤组织中表达升高，并通过增强细胞迁移、穿过细胞外基质的侵袭和扩散，发挥促进细胞运动和转移的正向调控作用，其肌动蛋白聚合能力与临床侵袭性行为相关。FMNL2通过与RhoA特异性鸟苷酸交换因子LARG直接相互作用，并作用于RhoA上游，促进RhoA/ROCK轴的激活，从而整合到RhoA信号通路中。RhoA/ROCK轴的激活反过来刺激肌动蛋白组装、应力纤维形成和血清反应因子依赖性转录。FMNL2-RhoA-ROCK通路是溶血磷脂酸诱导的RhoA激活、肌动蛋白重塑和结直肠癌细胞侵袭行为所必需的。此外，FMNL2还通过靶向NF-κB抑制剂COMMD10进行泛素介导的蛋白酶体降解，将细胞骨架重塑与促转移的转录和信号网络联系起来。 COMMD10 的减少可导致 p65 NF-κB 的核定位和活性增强，从而促进结直肠癌的侵袭、转移和不良临床预后。在肿瘤微环境中，FMNL2 通过其 N 端 GBD/FH3 结构域与表皮生长因子样蛋白 6 (EGFL6) 结合，促进结直肠癌的血管生成和转移。此过程可促进 EGFL6 装载到肿瘤来源的外泌体中，并增强 EGFL6 向内皮细胞的旁分泌信号传导。在内皮细胞中，EGFL6 与膜受体 CKAP4 结合，激活 ERK/MMP 通路，进而驱动内皮细胞迁移和新生血管形成。

特异性

FMNL2 Antibody (Mouse mAb) [A6K4] 可检测内源性 FMNL2 总蛋白水平。

背景

FMNL2 是一种与 diaphanous 相关的 formin 蛋白，它作为 Rho 家族 GTP 酶的效应分子和上游调节因子发挥作用，并在上皮和肿瘤环境中作为肌动蛋白依赖性过程（包括细胞形态、运动、侵袭和血管生成）的核心调控因子。该蛋白包含 N 端 GTP 酶结合域和 FH3 调节域、富含脯氨酸的片段以及 C 端 FH1 和 FH2 肌动蛋白组装结构域。这些结构域共同支持自身抑制的二聚体形成，该二聚体在 Rho 家族信号激活后，在皮层细胞骨架和前缘成核并延伸未分支的肌动蛋白丝。FMNL2 在细胞皮层和突起结构中富集，促进皮层肌动蛋白丝的动态变化、丝状伪足的形成和应力纤维的组织，从而塑造细胞极性、片状伪足结构以及驱动细胞向前运动和基质侵袭的牵引力。在结直肠癌中，FMNL2在转移性细胞系和肿瘤组织中表达升高，并通过增强细胞迁移、穿过细胞外基质的侵袭和扩散，发挥促进细胞运动和转移的正向调控作用，其肌动蛋白聚合能力与临床侵袭性行为相关。FMNL2通过与RhoA特异性鸟苷酸交换因子LARG直接相互作用，并作用于RhoA上游，促进RhoA/ROCK轴的激活，从而整合到RhoA信号通路中。RhoA/ROCK轴的激活反过来刺激肌动蛋白组装、应力纤维形成和血清反应因子依赖性转录。FMNL2-RhoA-ROCK通路是溶血磷脂酸诱导的RhoA激活、肌动蛋白重塑和结直肠癌细胞侵袭行为所必需的。此外，FMNL2还通过靶向NF-κB抑制剂COMMD10进行泛素介导的蛋白酶体降解，将细胞骨架重塑与促转移的转录和信号网络联系起来。 COMMD10 的减少可导致 p65 NF-κB 的核定位和活性增强，从而促进结直肠癌的侵袭、转移和不良临床预后。在肿瘤微环境中，FMNL2 通过其 N 端 GBD/FH3 结构域与表皮生长因子样蛋白 6 (EGFL6) 结合，促进结直肠癌的血管生成和转移。此过程可促进 EGFL6 装载到肿瘤来源的外泌体中，并增强 EGFL6 向内皮细胞的旁分泌信号传导。在内皮细胞中，EGFL6 与膜受体 CKAP4 结合，激活 ERK/MMP 通路，进而驱动内皮细胞迁移和新生血管形成。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

123 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: A549, Lane 3: IMR-32