FYCO1 Antibody (Rabbit mAb) [G4K12]

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生物描述

特异性 FYCO1 Antibody (Rabbit mAb) [G4K12] 可检测内源性 FYCO1 总蛋白水平。
背景 FYCO1，即含FYVE和卷曲螺旋结构域的蛋白1，是一种自噬衔接蛋白，它将巨自噬囊泡与微管运输机制连接起来，并将其定位到更广泛的内溶酶体运输网络中。该蛋白在自噬通路中发挥作用，而非在经典的转录因子或信号受体家族中发挥作用。FYCO1蛋白包含一个卷曲螺旋区、一个C端LC3相互作用区和一个FYVE结构域，该结构域可结合磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P），从而形成一个多价界面，可同时结合LC3修饰的自噬体膜、PI3P脂质和小GTP酶。 FYCO1 通过其 LC3 结合基序识别自噬体膜上的 ATG8/LC3 家族蛋白，并将这些囊泡与微管正端马达连接，从而建立向细胞周边的定向运输，并协调自噬区室的定位与晚期内体和溶酶体的分布。FYCO1 与 Rab7 的相互作用表明其是 Rab7 的效应蛋白，支持 Rab7 阳性自噬体和内体的成熟和运输，并将囊泡运动与晚期内吞和自噬过程中 Rab7 依赖的步骤相协调。 FYCO1募集至自噬体膜涉及通过其延伸的LIR基序识别LC3，随后FYVE结构域发生构象暴露以结合PI3P。该序列形成一个空间受限的连接，整合LC3、PI3P和Rab7，共同稳定沿微管的运输复合物。FYCO1的缺失导致自噬体聚集在核周而非向外移动，表明FYCO1活性对于自噬囊泡的有效重分布以及维持核周和外周自噬区室之间的动态平衡至关重要。FYCO1的过表达驱动Rab7阳性囊泡和LC3修饰的自噬体向微管正端移动，增加其在细胞外周的分布，表明FYCO1的剂量可以调节自噬囊泡的运输路径和降解细胞器的空间组织。 FYCO1能够同时结合LC3、PI3P和Rab7，这使其成为自噬体运输的中心组织节点，也是微管依赖性囊泡运动和成熟的关键衔接蛋白。FYCO1的失调，尤其是功能缺失，会改变自噬体的定位和Rab7阳性囊泡的动态变化。这些变化与晶状体等组织以及其他一些特殊细胞密切相关，在这些组织中，精确的自噬清除对于维持透明度或结构完整性至关重要。FYCO1的缺失或失调会破坏微管依赖性自噬运输，从而导致自噬相关疾病的发生。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:30 1:2000
反应性 Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 167 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 150s 以上)
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: Neuro-2a