GABARAP Antibody (Rabbit mAb) [P12P16]

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生物描述

特异性 GABARAP Antibody (Rabbit mAb) [P12P16] 可检测内源性 GABARAP 总蛋白水平。
背景 GABARAP，即γ-氨基丁酸受体相关蛋白，属于ATG8泛素样修饰蛋白家族，位于GABARAP/GATE-16亚家族中，该亚家族在功能上与同样由ATG8同源基因编码的LC3亚家族截然不同。LC3蛋白在自噬体形成过程中驱动不断生长的吞噬泡膜的延伸，而GABARAP亚家族成员则在后期发挥作用，支持自噬体的成熟而非初始膜的扩张。GABARAP通过直接结合LC3相互作用区依赖性地与待降解货物表面的受体蛋白结合来发挥这种成熟功能，这种基于受体的识别机制不仅限于胞质自噬，还延伸至细胞器选择性清除。在内质网自噬（即内质网的选择性自噬周转）中，GABARAP 与内质网驻留受体 TEX264 结合，TEX264 是一种单次跨膜蛋白，其 C 端胞质区带有一个 LC3 相互作用基序；含有 ATG8 的隔离膜在三向连接处包裹着一段 TEX264 阳性的内质网管状片段，形成两个并列膜的突触，这两个膜通过 TEX264 和 ATG8 家族蛋白（包括 GABARAP）之间的跨膜相互作用而结合在一起，隔离膜的扩张以拉链状过程扩展了这种内质网捕获，直到膜裂变将自噬体封闭在捕获的内质网片段周围。除了在膜转运中的作用外，GABARAP 还作为一种独立于自噬的膜定位信号支架发挥作用：它募集由底物适配器 KBTBD6 和 KBTBD7 构建的 CUL3 RING 泛素连接酶复合物，这些适配器通过特异性的 ATG8 相互作用基序优先与 GABARAP 结合，而非与其他 ATG8 家族成员结合。该 GABARAP 锚定的复合物泛素化 TIAM1（一种 RAC1 特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子），使其靶向蛋白酶体降解。与 GABARAP 的结合是该泛素化事件发生的必要条件，这意味着 GABARAP 不仅将连接酶复合物锚定在膜上，而且在机制上也是 TIAM1 周转本身所必需的。 KBTBD6 和 KBTBD7 的缺失会增加 TIAM1 的丰度，提高 RAC1 的活性，改变肌动蛋白细胞骨架的形态，减少黏着斑，并增强细胞的侵袭行为，从而将 GABARAP 支架蛋白介导的泛素连接酶活性与 RAC1 驱动的细胞骨架信号传导和细胞运动的空间限制直接联系起来。GABARAP 通过这两种机制不同的作用——内质网自噬过程中膜重塑受体的参与以及 RAC1 通路调控过程中泛素连接酶的支架作用——发挥着双重功能，成为 ATG8 蛋白在细胞器质量控制和局部信号转导界面上的双重作用，使其成为研究选择性自噬底物特异性以及细胞迁移和增殖中空间限制的小 GTP 酶信号传导的重要靶点。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 1:100 - 1:250
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 14 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293T, Lane 2: 293T (human GABARAP transfected)