Galectin 3 Antibody (Rabbit mAb) [K11P7]

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生物描述

特异性 Galectin 3 Antibody (Rabbit mAb) [K11P7] 可检测内源性 Galectin 3 总蛋白水平。
背景 半乳糖凝集素-3 (LGALS3) 是一种嵌合型β-半乳糖苷结合凝集素，属于半乳糖凝集素家族。它具有C端碳水化合物识别结构域 (CRD) 和N端富含脯氨酸和甘氨酸的区域，后者介导寡聚化。半乳糖凝集素-3 调控多种组织（包括心脏、肝脏、肾脏和胃肠道）中的细胞间和细胞-基质相互作用、生长、分化和炎症反应。CRD 可结合糖蛋白和细胞外基质成分上的 N-乙酰乳糖胺糖缀合物，而 N 端尾部则支持多聚体的形成，使半乳糖凝集素-3 在细胞表面形成网状结构，从而控制生长因子和免疫受体的聚集、内吞作用和信号阈值。在细胞内，半乳糖凝集素-3与Bcl-2等抗凋亡蛋白相互作用，并影响线粒体和核通路，从而调节细胞凋亡和细胞存活；而通过非经典途径分泌的细胞外半乳糖凝集素-3则与整合素、层粘连蛋白和其他基质分子结合，调节细胞黏附、迁移和血管生成，这表明存在区室特异性机制，这些机制共同塑造组织重塑和宿主反应。在免疫调节方面，半乳糖凝集素-3组织微环境，从而驱动炎症以及先天性和适应性免疫反应；它能诱导单核细胞向巨噬细胞分化，影响树突状细胞的命运，调节T细胞凋亡，并抑制B细胞分化为抗体分泌浆细胞。在小鼠模型中，其存在与否会通过改变细胞因子谱（IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-10）和巨噬细胞极化状态，从而改变实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫介导性肝炎和糖尿病的严重程度。从机制上讲，半乳糖凝集素-3通过影响受体组织和细胞内伴侣，进而影响包括MAPK和Wnt/β-catenin在内的信号通路，从而促进癌症中的增殖和存活，以及代谢和心血管疾病中的纤维化和炎症信号传导。然而，具体的信号通路连接通常取决于组织和环境。临床上，半乳糖凝集素-3在慢性炎症性疾病、纤维化疾病和癌症中经常上调，循环中半乳糖凝集素-3水平升高与慢性心力衰竭、慢性肾脏病和心肾综合征的不良预后相关，因此半乳糖凝集素-3被开发为早期检测和风险分层的生物标志物，并促使人们探索半乳糖凝集素-3抑制剂在治疗纤维化和肿瘤进展方面的应用。在肾脏病理学中，半乳糖凝集素-3促进肾纤维化和肾小球炎症，参与肾脏发生和急性损伤后的再生，并与狼疮性肾炎、代谢性肾病和肾细胞癌相关。其在免疫调节、伤口修复和纤维化发生中的双重作用，使其既是预后标志物，也是潜在的治疗靶点。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IHC IF FCM
1:5000 - 1:10000 1:250 1:1000 1:50
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 26 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: A375, Lane 2: HeLa, Lane 3: A431, Lane 4: RAW264.7