Galectin 8/Gal-8 Antibody (Rabbit mAb) [J21J20] Datasheet

生物描述

特异性	Galectin 8/Gal-8 Antibody (Rabbit mAb) [J21J20] 可检测内源性 Galectin 8/Gal-8 总蛋白水平。
背景	半乳糖凝集素-8属于半乳糖凝集素家族的串联重复亚家族，是一类β-半乳糖苷结合凝集素。其结构与原型半乳糖凝集素的区别在于，它具有两个不同的碳水化合物识别结构域：N端结构域和C端结构域，这两个结构域通过连接肽连接，而非像原型半乳糖凝集素那样由单个自二聚化结合结构域连接。这两个结构域具有显著不同的聚糖结合特异性：N端结构域对α2-3-唾液酸化和3'-硫酸化的β-半乳糖苷具有很强的优先亲和力，而C端结构域则更倾向于非唾液酸化的寡糖结构，包括聚N-乙酰乳糖胺以及A型和B型血型抗原聚糖。这使得单个半乳糖凝集素-8分子具有两个功能不同的识别表面，能够同时结合不同类型的细胞表面和细胞内糖缀合物。半乳糖凝集素-8 作为一种胞质危险受体，通过检测宿主聚糖来监测内体和溶酶体膜的完整性。当这些膜破裂时，无论是沙门氏菌、李斯特菌或志贺氏菌等入侵细菌造成的破裂，还是无菌性膜损伤造成的破裂，宿主聚糖都会异常暴露于胞质中。由于复杂的聚糖通常局限于囊泡膜的腔面（面向细胞外侧），因此它们突然暴露于胞质中就构成了一个明确的膜破裂信号，而半乳糖凝集素-8 正好能够直接识别该信号。当半乳糖凝集素-8与受损的含菌液泡上暴露的聚糖结合时，它会募集自噬受体NDP52至该位点。这种半乳糖凝集素-8依赖的NDP52募集是短暂的，并且先于后续的泛素依赖性NDP52募集阶段。这表明半乳糖凝集素-8通过一种聚糖感知机制启动抗菌自噬，该机制位于经典的用于标记病原体以进行自噬清除的多聚泛素包被途径的上游，并且独立于该途径。半乳糖凝集素-8向受损囊泡的募集独立于核心自噬机制，因为即使在缺乏ATG5的细胞中，该过程也能正常进行，这证实半乳糖凝集素-8的功能是作为囊泡损伤的真正模式识别传感器，而不是自噬途径本身的下游组分。除了这种先天免疫和危险感知功能外，半乳糖凝集素-8 通过其两个结构不同的 CRD 与多种细胞表面糖蛋白配体结合，包括整合素、CD44、CD45 和 basigin/CD147，介导细胞粘附、免疫细胞调节和 T 淋巴细胞活性调节。此外，半乳糖凝集素-8 在多种人类肿瘤中表达升高，加上其在促进血管生成和淋巴管生成方面的既定作用，使得半乳糖凝集素-8，特别是其 N 端 CRD，成为癌症小分子抑制剂开发中积极追求的目标。

特异性

Galectin 8/Gal-8 Antibody (Rabbit mAb) [J21J20] 可检测内源性 Galectin 8/Gal-8 总蛋白水平。

背景

半乳糖凝集素-8属于半乳糖凝集素家族的串联重复亚家族，是一类β-半乳糖苷结合凝集素。其结构与原型半乳糖凝集素的区别在于，它具有两个不同的碳水化合物识别结构域：N端结构域和C端结构域，这两个结构域通过连接肽连接，而非像原型半乳糖凝集素那样由单个自二聚化结合结构域连接。这两个结构域具有显著不同的聚糖结合特异性：N端结构域对α2-3-唾液酸化和3'-硫酸化的β-半乳糖苷具有很强的优先亲和力，而C端结构域则更倾向于非唾液酸化的寡糖结构，包括聚N-乙酰乳糖胺以及A型和B型血型抗原聚糖。这使得单个半乳糖凝集素-8分子具有两个功能不同的识别表面，能够同时结合不同类型的细胞表面和细胞内糖缀合物。半乳糖凝集素-8 作为一种胞质危险受体，通过检测宿主聚糖来监测内体和溶酶体膜的完整性。当这些膜破裂时，无论是沙门氏菌、李斯特菌或志贺氏菌等入侵细菌造成的破裂，还是无菌性膜损伤造成的破裂，宿主聚糖都会异常暴露于胞质中。由于复杂的聚糖通常局限于囊泡膜的腔面（面向细胞外侧），因此它们突然暴露于胞质中就构成了一个明确的膜破裂信号，而半乳糖凝集素-8 正好能够直接识别该信号。当半乳糖凝集素-8与受损的含菌液泡上暴露的聚糖结合时，它会募集自噬受体NDP52至该位点。这种半乳糖凝集素-8依赖的NDP52募集是短暂的，并且先于后续的泛素依赖性NDP52募集阶段。这表明半乳糖凝集素-8通过一种聚糖感知机制启动抗菌自噬，该机制位于经典的用于标记病原体以进行自噬清除的多聚泛素包被途径的上游，并且独立于该途径。半乳糖凝集素-8向受损囊泡的募集独立于核心自噬机制，因为即使在缺乏ATG5的细胞中，该过程也能正常进行，这证实半乳糖凝集素-8的功能是作为囊泡损伤的真正模式识别传感器，而不是自噬途径本身的下游组分。除了这种先天免疫和危险感知功能外，半乳糖凝集素-8 通过其两个结构不同的 CRD 与多种细胞表面糖蛋白配体结合，包括整合素、CD44、CD45 和 basigin/CD147，介导细胞粘附、免疫细胞调节和 T 淋巴细胞活性调节。此外，半乳糖凝集素-8 在多种人类肿瘤中表达升高，加上其在促进血管生成和淋巴管生成方面的既定作用，使得半乳糖凝集素-8，特别是其 N 端 CRD，成为癌症小分子抑制剂开发中积极追求的目标。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

36 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: RAW 264.7, Lane 2: C2C12, Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain