GBE1 Antibody [P1M6] Datasheet

生物描述

特异性	GBE1 Antibody [P1M6] 可检测内源性 GBE1 总蛋白水平。
背景	糖原分支酶1 (GBE1) 编码一种重要的糖基转移酶，负责将α-1,6-糖苷键分支点引入线性α-1,4-葡萄糖链中。这一过程对于合成主要存在于肝脏和肌肉中的致密可溶性糖原颗粒至关重要，从而维持能量稳态。GBE1 具有一个N端螺旋结构域、一个碳水化合物结合模块48 (CBM48，氨基酸残基76-183)、一个包含Asp357-Glu412-Asp481催化三联体和Tyr329底物结合裂隙的中央(βα)8催化桶状结构域，以及一个C端淀粉酶样桶状结构域。大多数致病突变集中在催化区域，破坏蛋白质折叠或糖基转移活性。 GBE1 位于糖原合成酶的下游，负责生成分支状糖原结构。这些分支状糖原结构在禁食或运动期间会被磷酸化酶迅速动员，对维持血糖平衡至关重要。GBE1 双等位基因突变会导致 IV 型糖原贮积症（GSD IV，安德森病），其特征是酶活性缺失或降低、不溶性多聚葡萄糖体积聚、肝功能衰竭、肌病，以及重症病例中的婴儿死亡。而部分缺陷，例如在德系犹太人中常见的 p.Tyr329Ser 突变，则会导致成人多聚葡萄糖体病（APBD），其特征是由于中枢神经系统多聚葡萄糖积聚而引起的进行性神经退行性变、痉挛和神经源性膀胱。

特异性

GBE1 Antibody [P1M6] 可检测内源性 GBE1 总蛋白水平。

背景

糖原分支酶1 (GBE1) 编码一种重要的糖基转移酶，负责将α-1,6-糖苷键分支点引入线性α-1,4-葡萄糖链中。这一过程对于合成主要存在于肝脏和肌肉中的致密可溶性糖原颗粒至关重要，从而维持能量稳态。GBE1 具有一个N端螺旋结构域、一个碳水化合物结合模块48 (CBM48，氨基酸残基76-183)、一个包含Asp357-Glu412-Asp481催化三联体和Tyr329底物结合裂隙的中央(βα)8催化桶状结构域，以及一个C端淀粉酶样桶状结构域。大多数致病突变集中在催化区域，破坏蛋白质折叠或糖基转移活性。 GBE1 位于糖原合成酶的下游，负责生成分支状糖原结构。这些分支状糖原结构在禁食或运动期间会被磷酸化酶迅速动员，对维持血糖平衡至关重要。GBE1 双等位基因突变会导致 IV 型糖原贮积症（GSD IV，安德森病），其特征是酶活性缺失或降低、不溶性多聚葡萄糖体积聚、肝功能衰竭、肌病，以及重症病例中的婴儿死亡。而部分缺陷，例如在德系犹太人中常见的 p.Tyr329Ser 突变，则会导致成人多聚葡萄糖体病（APBD），其特征是由于中枢神经系统多聚葡萄糖积聚而引起的进行性神经退行性变、痉挛和神经源性膀胱。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000 - 1:10000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

76 kDa,80 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Human fetal liver, Lane 2: PC-3